[发明专利]百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

权利要求书

1.百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)百合总蛋白质的提取：

①称取1～2g新鲜百合叶片或鳞茎于-20℃预冷的研钵中，加入10～20ml液氮，快速研磨至粉状；

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分2～3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存过夜；取过夜的离心管于离心机上20000rpm，离心20min；弃上清；

③加入20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液，用枪头把离心管内的沉淀弄碎，振荡，于-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上20000rpm，离心15min，弃上清；

④重复步骤(1)③2次；

⑤在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后，即为提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离心管中，-80℃保存；

(2)百合总蛋白质的纯化和溶解

①称取步骤(1)⑤提取的蛋白质干粉40～50mg于底部连接有离心管的过滤柱中，按每1mg蛋白质干粉加7M水化液15μl的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室温放置1h；

所述7M水化液的制备方法为：称取8.4g尿素、3.04g硫脲、0.8g 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐于50ml离心管中，并用超纯水稀释至20ml；随后将其分装至1.5～2ml的离心管中，每个离心管中分装1ml，备用；

②将底部连接有离心管的过滤柱于离心机上12000rpm，离心15min，然后弃去过滤柱，将过滤柱底部连接的离心管所收集到的滤液转移至另一离心管中；

③加入1600～2000μl附加0.1％二硫苏糖醇的无水丙酮，边加边摇匀，-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上15000rpm，4℃离心30min，弃上清；

④加入1ml在4℃预冷的附加0.1％二硫苏糖醇的超纯水，在离心机上15000rpm，4℃离心25min，弃上清；

⑤加入附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液150～200μl即为百合总蛋白质溶解液；

所述附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液制备方法为：取步骤(2)①制备的7M水化液1ml，用前加入2μl载体两性电解质和0.01g二硫苏糖醇即为附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液；

(3)百合总蛋白质溶解液的质量检测

①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上方顶端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10％的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待所述分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方顶面灌入5％的浓缩胶，灌入的所述浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电泳槽中，并在蛋白质电泳槽中加入1×电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖将加样孔内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑；取步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液4μl，加入2μl的溴酚蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时，用低电流5mA电泳或用低电压50V电泳，待溴酚蓝指示剂成一条线后，再加大电流为10mA电泳或加大电压为150V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳；所述双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板的宽度均为10cm，长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm；

②停止电泳后，撬开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件，胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好；继续进行下一步百合总蛋白质的浓度测定；

(4)百合总蛋白质的浓度测定

取步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用Bradford法测定其百合总蛋白质的浓度，测定的百合总蛋白质浓度在3μg/μl以上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液置于-80℃保存；

(5)第一向等电聚焦

①上样水化

用与步骤(2)⑤中相同的附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液将步骤(4)中于-80℃保存的百合总蛋白质溶解液稀释至3μg/μl，取所稀释的浓度为3μg/μl的百合总蛋白质溶解液300μl放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯度胶条的保护膜去掉，然后将固定化pH梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化pH梯度胶条吸收2-3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2～3ml矿物油水化14～16h；

②聚焦

将盐桥用ddH2O润湿后置于聚焦盘两端；对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序进行聚焦，所述的等电聚焦程序如下：

S1除盐：250V，梯度为快速，2.5h；S2除盐：1000V，梯度为快速，2.5h；S3升压：9000V，梯度为线性，4.5h；S4聚焦：9000V，梯度为快速，65000v/h；S5保持：500V，梯度为快速，5h；

③第一次平衡：

将聚焦盘槽内固定化pH梯度胶条转移至水化盘中的槽内，水化盘中的每个槽转移一根经步骤(5)②聚焦的固定化pH梯度胶条，再向槽内加入5ml附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I，然后将水化盘置于摇床上40rpm摇晃15min即第一次平衡结束；

所述附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I的制备方法：首先配制胶条平衡缓冲液母液：容量瓶中加入36g尿素、2g十二烷基磺酸钠、1.5mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐25ml和20％的甘油20ml，用超纯水定容至100ml得胶条平衡缓冲液母液，分装至10ml的离心管中，每管10ml，-20℃冰箱保存备用；取一支10ml的胶条平衡缓冲母液，用前加入0.2g二硫苏糖醇并充分混匀即为附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I；

④第二次平衡:

第一次平衡结束后，倒掉或吸掉水化盘中的胶条平衡缓冲液I，并用滤纸吸取多余的胶条平衡缓冲液I，将水化盘中的槽内的固定化pH梯度胶条取出竖直放在滤纸上，让滤纸吸取多余的胶条平衡缓冲液I，以免损失蛋白或损坏凝胶表面，然后将固定化pH梯度胶条放回水化盘中的槽内，再加入5ml附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续将水化盘在水平摇床上40rpm摇晃15min即第二次平衡结束，第二次平衡结束后，倒掉或吸掉水化盘中的附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ，并用滤纸吸取多余的附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ；

所述附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ的制备：取步骤(5)③中所述的一支10ml的胶条平衡缓冲母液，用前加入0.25g碘乙酰胺并混匀即为附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ；

(6)第二向SDS-PAGE电泳：

①制备聚丙烯酰胺凝胶

将一块大双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且大双层玻璃板的上方朝上并使大双层玻璃板上方顶端面为水平，量取10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液注入所述大双层玻璃板之间，注入的所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液上方顶面距离大双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，在所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液上方顶面用无水乙醇封面，聚合30min，当所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液与无水乙醇分层后，表明10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液已聚合即制成聚丙烯酰胺凝胶；所述大双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为大双层玻璃板的上方，大双层玻璃板中的长玻璃板和短玻璃板的宽度均为20cm，长玻璃板的长度为18cm，短玻璃板的长度为16cm；

所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液的制备：取超纯水15.9ml、30％聚丙烯酰胺13.3ml、1.5mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10ml、10％十二烷基磺酸钠0.4ml、10％过硫酸氨0.4ml和四甲基乙二胺0.016ml混匀即为10％聚丙烯酰胺凝胶溶液；

所述30％聚丙烯酰胺的制备：称取150g丙烯酰胺、4g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水定容至500ml，滤纸过滤后所得滤液即为30％聚丙烯酰胺，装入棕色瓶中4℃冰箱保存；

所述1.5mol/L pH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的制备：称取90.75g的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐加入400ml超纯水，再用1mol/L盐酸调pH至8.8，加超纯水定容至500ml，4℃冰箱保存；

所述10％十二烷基磺酸钠的制备：称取10g十二烷基磺酸钠，用超纯水定容至100ml，室温保存；

所述10％过硫酸氨的制备：称取0.1g过硫酸氨，用超纯水定容至1ml，4℃冰箱保存；

②用滤纸吸去步骤(6)①中所述的大双层玻璃板之间聚丙烯酰胺凝胶上方多余的无水乙醇后，将该大双层玻璃板平放在桌面上，长玻璃板朝下，短玻璃板朝上，大双层玻璃板的上方对着操作人员；

③在桌面上放置干的两层滤纸，将在步骤(5)经第二次平衡后的水化盘中的固定化pH梯度胶条取出放在桌面上所述的两层滤纸上，另一份两层滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分后，直接置于固定化pH梯度胶条上表面，吸干固定化pH梯度胶条上的矿物油及固定化pH梯度胶条上多余的百合总蛋白质溶解液；

④用镊子夹住步骤(6)③经滤纸吸干矿物油及多余百合总蛋白质溶解液的固定化pH梯度胶条完全浸没在1×电泳缓冲液中1～2s，所述1×电泳缓冲液与步骤(3)①中所述的1×电泳缓冲液相同，然后取出固定化pH梯度胶条放在步骤(6)②中平放在桌面上的所述大双层玻璃板中长玻璃板长出的长玻璃板的上表面，且该固定化pH梯度胶条的支撑膜贴在长玻璃板的上表面，然后用镊子将该固定化pH梯度胶条推入该大双层玻璃板之间，且使该固定化pH梯度胶条位于该大双层玻璃板之间聚丙烯酰胺凝胶的下面，并与该聚丙烯酰胺凝胶的胶面完全接触，不要在所述固定化pH梯度胶条下方产生任何气泡，在用镊子推固定化pH梯度胶条时，推动该固定化pH梯度胶条背面的支撑膜，镊子碰到该固定化pH梯度胶条的胶面；

⑤将步骤(6)④放有固定化pH梯度胶条的大双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，短玻璃板的平面对着操作人员，大双层玻璃板的上方朝上，从大双层玻璃板的上方向大双层玻璃板之间加入低熔点琼脂糖封胶液封面，放置5min，使低熔点琼脂糖封胶液凝固；

所述低熔点琼脂糖封胶液的制备：在容量瓶中加入低熔点琼脂糖0.5g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.303g、甘氨酸1.44g，1ml 10％十二烷基磺酸钠、100μl的1％溴酚蓝，加超纯水定容至100ml，80℃度水浴加热溶解至澄清即为低熔点琼脂糖封胶液，室温保存；

⑥在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将步骤(6)⑤封有低熔点琼脂糖封胶液的大双层玻璃板移至电泳槽的槽内，向电泳槽槽内加入1×电泳缓冲液，所述1×电泳缓冲液与步骤(3)①中所述的1×电泳缓冲液相同，接通电源，起始时用低电流10mA电泳或用低电压100V电泳,待大双层玻璃板之间的百合总蛋白质溶解液完全从大双层玻璃板之间的固定化pH梯度胶条中走出，看到溴酚蓝指示剂呈一条直线后，再加大电流为20mA电泳或加大电压为300V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该大双层玻璃板底部边缘时即停止电泳；电泳结束后，撬开大双层玻璃板，取出大双层玻璃板之间的聚丙烯酰胺凝胶，并切角以作记号；

(7)染色、脱色：

预先将200ml固定液加入塑料盒中，再将步骤(6)⑥取出的聚丙烯酰胺凝胶放入固定液中，盒上做标记，将塑料盒放在摇床上以40rpm的转速摇动3h；然后倒掉塑料盒内的固定液，用超纯水清洗塑料盒内的聚丙烯酰胺凝胶2次，加入附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液200ml，在摇床上以40rpm的转速摇动染色12h，弃去染色液，用超纯水漂洗至没有考马斯亮蓝G250残渣；加入200ml脱色液，在摇床上以40rpm的转速摇动脱色2d，所述附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液与步骤(3)②中所述的附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液相同，所述脱色液与步骤(3)②中所述的脱色液相同；

所述固定液的制备：量取乙醇400ml、乙酸400ml，用超纯水定容至1L；

(8)图像采集，将步骤(7)经脱色的聚丙烯酰胺凝胶置于校准型光密度仪上拍照并保存文件获得百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。