[发明专利]百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

说明书

本发明公开一种百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。该方法在百合总蛋白质的提取中设置转速为20000rpm，并反复沉淀离心至少3次，使得提取出来的百合总蛋白质颜色较白，质量好；增加了蛋白质的质量检测步骤，采取跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的方式检测所提取出来蛋白质的质量，避免了后续第一向等电聚焦效果不好的问题。改进了第一向等电聚焦过程中聚焦程序，将聚焦程序中的步骤S1和S2两个除盐步骤的时间延长至2.5h，较好地去除了蛋白质的盐分，从而较好地完成了聚焦程序。本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱背景清晰，蛋白质点多，蛋白质点分布均匀。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

背景技术

百合(Lilium spp.)被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。据统计，2009年全球种球生产面积为35,749公顷,其中荷兰种植面积为23,561公顷，占66％，英国种植面积为5,400公顷，占15％，中国种植面积为4,680公顷，占13％。全球百合种球的贸易额已达20多亿美元，年贸易量达25亿粒以上。据农业部的统计数据，我国2013年百合鲜切花销售额达42.95亿元，位居鲜切花销售额的首位，具有重要的经济价值。

尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)是引起百合枯萎病的土传真菌，全世界百合种植区域均有被其感染和危害。云南作为我国重要的百合优质鲜切花产区，枯萎病时有爆发，轻者导致产量损失20-30％，严重时可造成百合绝收，且污染种植土壤，极大影响云南百合花卉产业的可持续发展。镰刀菌是一种在许多作物上引起严重病害的土传真菌，很难进行有效控制。因此选育和利用抗病品种成为主要的防治措施，采用蛋白质双向电泳技术来挖掘百合的抗病相关蛋白，可为百合抗病细胞工程育种提供理论依据。

植物在病原侵染胁迫下，除了会发生一些组织解剖学上的变化外，一些基因表达也会发生改变，有些蛋白的合成会受到抑制，同时又会有新的蛋白合成。这些病程相关基因和蛋白(Pathogenesis-related gene/protein,PR)是植物表现抗性的遗传基础抗性中的关键因子，也是抗病机制研究的基础。研究百合的病程相关蛋白可为抗病细胞工程育种提供理论依据。

双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术是蛋白质组研究的核心技术之一，也是复杂蛋白质分析分辨率最高的工具之一，其第一向为等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)，根据蛋白的等电点不同进行分离；其第二向为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，是根据蛋白质亚基相对分子质量的不同而将第一向分离后的蛋白质进一步分离。经过电荷和质量的两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。近年来，蛋白质双向电泳技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆等作物的研究中已得到广泛应用，但对于百合蛋白质双向电泳技术的研究国内外还未见报道。因此本发明通过优化百合蛋白质提取及双向电泳的各项参数，发明了百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

发明内容

本发明目的是提供一种适宜百合的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

本发明所提供的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：

(1)百合总蛋白质的提取：

①称取1～2g新鲜百合叶片或鳞茎于-20℃预冷的研钵中，加入10～20ml液氮，快速研磨至粉状；

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分2～3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存过夜；取过夜的离心管于离心机上20000rpm，离心20min；弃上清；