[发明专利]一种石油降解菌剂及其制备方法

权利要求书

1.一种石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将惰性柄杆菌(Caulobacter segnis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、抗酚小短杆菌(Brachybacterium phenoliresistens)、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)以及鲑色锁掷孢酵母(Sporidiobolus salmonicolor)菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为10⁹～10¹⁰cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节杆菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；

(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶(10-15)，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27-30℃条件下连续发酵48-60小时；

(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；

(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(20-40)，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(0.5-0.8)；

(5)称取重量份数为15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存；

所述惰性柄杆菌(Caulobacter segnis)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC菌种编号NO.4.1475；

所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC菌种编号为NO.1693；

所述抗酚小短杆菌(Brachybacterium phenoliresistens)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC菌种编号为NO.23825；

所述球形节杆菌，拉丁学名Arthrobacter globiformis，属于细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，放线菌纲Actinobacteria，放线菌目Actinomycetales，微球菌科Micrococcaceae，节细菌属Arthrobacter；

所述鲑色锁掷孢酵母(Sporidiobolus salmonicolor)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC菌种编号为NO.31636；

所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5-8g的酵母粉、5-8g麦麸、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-1g贝壳粉、0.5-0.9g膨润土、0.8-1.2g的MgSO₄·7H₂O、0.3-0.6g的Na₂HPO₄、0.1-0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L；

所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。

2.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的发酵温度为28℃。

3.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶30。

4.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.6。