[发明专利]快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT‑RPA检测试剂盒及其用途。所述试剂盒包括有一对引物和一条探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。实验证明本发明的试剂盒能够特异性的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP‑PRRSV)，与猪瘟病毒、C型‑猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒等不反应。实验证明，本发明的试剂盒能够在40℃，扩增20min的条件下检出最少70个拷贝的模板，且与RT‑qPCR具有很高的符合度。由此说明，本发明的试剂盒能够快捷、高效、灵敏的检测HP‑PRRSV，本发明的提出为HP‑PRRSV的鉴别诊断提供了有效技术手段。

技术领域

本发明涉及一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。在大多数情况下，尽管缺少使用这些方法的实验设备，并且缺乏综合管理这些疾病的常规操作。因此，这些国家长期持续的受到这些疾病的困扰，包括艾滋病、麻疹以及肺结核病，以及2014年爆发的埃博拉病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在陆续被开发，这些方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。与常规方法相比较，这些方法具有很高的敏感性和特异性，因而促使不同的公司对这些等温扩增技术商业化，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增(strand displacementamplification,Becton Dickson,USA)。LAMP技术已经比较成熟，并且得到广泛使用，到目前为止，已经超过1000份关于LAMP在不同疾病诊断中应用的科研文章，可是，该技术距离在发展中国家应用仍然有较大的距离，而且该技术也有不足的地方，比如试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。不像其他的等温扩增方法，RPA扩增能够以非常快的速度(20分钟以内)扩增出DNA/RNA，该扩增可以在人体温温度下，或者更低的温度下进行。RPA扩增可以使用所有的基于PCR的扩增检测，尤其是实时荧光检测以及试纸条检测。RPA已经被英国剑桥的Twist^DX商业化，商业化的试剂盒以一种冻干的形式储存，以便于在条件差的环境下使用，可以根据使用者设计的特异引物和探针来进行特异的扩增，目前该公司提供了商业化的弯曲杆菌、红绸鱼、李斯特菌以及沙门氏菌检测试剂盒。RPA技术自2006年问世以来，快速的冲击着田间分子检测市场，目前该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业上，比如用于检测土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原。