[发明专利]抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗乙 肝表面抗原的荧光抗体的制备方法包括如下步骤：

S1：获得M.BarkeriPylRS突变库；

S2：获得香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶 (CouKRS)突变体；

S4：将步骤S3中的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因 coukrs与毕赤酵母表达质粒pPICZ重组，获得酵母表达质粒pPICZ-CouKRS；

S5：设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗HBsAg 抗体的突变DNA序列与质粒pPIC9K重组，获得酵母表达质粒 pPIC9K-antiHBsAg；

S6：将步骤S4获得的pPICZ-CouKRS线性化，将步骤S5获得的 pPIC9K-antiHBsAg线性化；

S7：将步骤S6线性化后的pPICZ-CouKRS和线性化后的 pPIC9K-antiHBsAg按照第一预设的比例混合，经过电击转化，导入到毕赤酵 母X33中，获得菌株A；

S8：将步骤S7获得的菌株A进行抗性筛选，获得阳性菌株组B；

S9：将步骤S8获得的阳性菌株组B分别进行PCR筛选鉴定，获得若干 个阳性菌株组C；

S10：将步骤S9获得的阳性菌株组C中的单克隆酵母涂布于含有G418 的YPDS固体培养基中培养，以验证所述单克隆酵母的G418抗性，若验证成 功，则获得具备识别并携带7-羟基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗体的63位 点的单克隆酵母D；

S11：将步骤S10获得的单克隆酵母D扩大培养、离心、超声破碎以及镍 柱纯化得到抗乙肝表面抗原荧光抗体。

2.如权利要求1所述的抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征 在于，所述步骤S1包括如下步骤：

S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；

S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上， 获得重组质粒A；

S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物 r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物 r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；

S104：以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引 物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物 r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预定的比 例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库。

3.如权利要求2所述的抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征 在于，所述第一预定的比例为1:1。

4.如权利要求1所述的抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征 在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S21：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二预 设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；

S22：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于60℃ 搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母 液C。

5.如权利要求4所述的抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，其特征 在于，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。