[发明专利]抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的 制备方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎(简称乙型肝炎)是由乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV) 感染引起的全球性重大公共卫生问题，也是最常见的肝病病因。据世界卫生 组织统计，全球有20亿人曾感染过HBV，其中约有3亿人发展成为HBV 慢性感染者。HBV慢性感染是导致肝硬化和肝癌的主要原因，世界上约有1/3 的肝硬化患者和3/4以上的肝癌患者是由乙型肝炎慢性感染所致。每年有近 100万人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。中国是HBV感染 的高发地区，目前中国有9300万HBV慢性感染人群。近年来，随着乙肝疫 苗的推广，新发乙型肝炎数量减少，但中国每年仍有10万例新发HBV感染 者。乙型肝炎防控的难度不容忽视。乙肝表面抗原(HBsAg)定量检测是评 价慢乙肝治疗效果的重要手段。中华医学会发布的2015年版《慢性乙型肝炎 防治指南》指出：对血清中的乙肝表面抗原进行定量监测，可用于预测疾病 进展、抗病毒疗效和预后，停药后获得持久的HBsAg消失为慢乙肝治疗的 理想终点。欲评估慢乙肝HBsAg是否消失，则要求对HBsAg的定量达到精 确的水准。受技术所限，HBsAg的检测一直处于手工定性或者半定量状态。 最近，国外的公司有通过化学显色的方法来定量HBsAg，然而化学显色方法 灵敏度滴，检测不到血液中低丰度的HBsAg，会给HBsAg的检测带来误判。 荧光发光检测的方法比化学显色灵敏10000倍以上，可以检测到样本中单个 拷贝的靶标的检测。

基于此，有必要设计一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，用来 大幅度提高HBsAg检测的灵敏度，实现HBsAg的精确定量检测，辅助加强对 乙型肝炎的发病的监控力度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法，旨 在提高HBsAg的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于HBsAg的精确 定量检测。

为实现上述目的，本发明提供一种抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方 法，所述抗乙肝表面抗原的荧光抗体的制备方法包括如下步骤：

S1：获得M.BarkeriPylRS突变库；

S2：获得香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶 (CouKRS)突变体；

S4：将步骤S3中的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的编码基因 coukrs与毕赤酵母表达质粒pPICZ重组，获得酵母表达质粒pPICZ-CouKRS；

S5：设计抗HBsAg抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗HBsAg 抗体的突变DNA序列与质粒pPIC9K重组，获得酵母表达质粒 pPIC9K-antiHBsAg；

S6：将步骤S4获得的pPICZ-CouKRS线性化，将步骤S5获得的 pPIC9K-antiHBsAg线性化；

S7：将步骤S6线性化后的pPICZ-CouKRS和线性化后的 pPIC9K-antiHBsAg按照第一预设的比例混合，经过电击转化，导入到毕赤酵 母X33中，获得菌株A；

S8：将步骤S7获得的菌株A进行抗性筛选，获得阳性菌株组B；

S9：将步骤S8获得的阳性菌株组B分别进行PCR筛选鉴定，获得若干 个阳性菌株组C；

S10：将步骤S9获得的阳性菌株组C中的单克隆酵母，涂布于含有G418 的YPDS固体培养基中培养，以验证所述单克隆酵母的G418抗性，若验证成 功，则获得具备识别并携带7-羟基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗体的63位 点的单克隆酵母D；

S11：将步骤S10获得的单克隆酵母D扩大培养、离心、超声破碎以及镍 柱纯化得到抗乙肝表面抗原荧光抗体。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；

S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上， 获得重组质粒A；