[发明专利]牛奶中尿素氮检测试剂盒

权利要求书

1.牛奶中尿素氮检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括96孔反应板、浓缩沉淀剂Ⅰ、 浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液，所述96孔反应板为96 孔平底带盖酶标板；所述浓缩沉淀剂Ⅰ为亚铁氰化钾溶液，浓度范围为2.12～20.6g/dl；所 述浓缩沉淀剂Ⅱ为乙酸锌溶液，浓度范围5.8～30g/dl；所述缓冲液为乙二胺四乙酸钠缓冲 液，浓度范围为1％～10％，pH值为6.0～7.0；所述酶液为尿酶溶液，浓度范围为5～100U/ml； 所述显色剂Ⅰ为酚或其衍生物与亚硝基铁氰化钾混合溶液，酚或其衍生物浓度范围为 0.05％～5％；亚硝基铁氰化钾浓度范围0.01％～5％；所述显色剂Ⅱ为次氯酸钠溶液，浓度 范围为1％～10％；所述对照液为已知浓度的尿素对照品溶液，浓度范围为0.1～10mg/dl； 所述浓缩沉淀剂Ⅰ和浓缩沉淀剂Ⅱ使用前分别以纯化水按照体积比1:19的比例稀释，混 匀后使用；上述的百分数均为质量百分含量。

2.根据权利要求1所述的牛奶中尿素氮检测试剂盒的应用方法，其特征在于：

第一步，将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，每种液体试剂使用 前均须摇匀；所述试剂包括浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显 色剂Ⅱ和对照液；所述的浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ使用前与纯化水按照体积比1:19的比 例稀释；

第二步，样品液；

精密量取牛奶样品0.1mL，加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加入0.95mL 稀释后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液；

第三步，96孔反应板编号；

取出96孔反应板；预留2个空白孔，编号为微孔1和微孔2；

对照液做5个浓度，每个浓度做2孔平行，将对照液对应微孔按序编号为微孔3～微孔12， 并记录对照液微孔所在位置；

剩余微孔按序编号为微孔13～微孔96，用于检测不同牛奶样品中尿素氮的含量，每个牛 奶样品均需按照第二步处理得到相应的样品液；每个样品液最少做2孔平行，记录不同样品 液对应微孔所在的位置；

第四步，加对照液和样品液；

加入缓冲溶液60μl到96孔反应板中的空白孔；

微孔3～微孔12中分别加对照液10μl、20μl、30μl、40μl、60μl，然后再依次加入缓冲溶 液50μl、40μl、30μl、20μl、0μl，使得每个对照液对应的微孔中液体体积均为60μl；

从微孔13开始，2孔平行，分别加样品液60μl，至所有样品液加样完成；随即加入缓冲 溶液10μl/孔，振荡混匀，加入酶液40μl/孔振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应 20min；

第五步，显色；

加入显色剂Ⅰ100μl/孔，随即加入显色剂Ⅱ50μl/孔，振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光 环境中反应20min；

第六步，测定；

设定酶标仪于630nm处，以微孔1和微孔2为空白，测定每孔光密度值；

第七步，结果；

计算平行孔光密度值的平均值，分别得到空白光密度值，对照液光密度值及样品液光密度 值；以对照液孔对照液加入体积10μl、20μl、30μl、40μl、60μl为横坐标，对应的对照 液光密度值与空白光密度值的差值为纵坐标，计算尿素氮吸收曲线；把样品液光密度值与空 白光密度值之差代入尿素氮吸收曲线，计算相应的体积v；按下式计算牛奶样品中尿素氮的 含量：

尿素氮含量＝v/3×1mg/dl。