[发明专利]牛奶中尿素氮检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于畜牧学、动物营养与饲料科学中的尿素氮检测技术领域，具体是指一种牛奶 中尿素氮检测试剂盒。

背景技术

利用牛奶尿素氮(milkureanitrogen,MUN)来评价奶牛日粮能氮平衡、蛋白需要量、氮 利用率、繁殖率以及诊断代谢疾病已成为世界范围内奶牛科学研究的热点，而且牛奶取样方 便，不会对奶牛造成应激。

测定MUN的方法主要有二乙酰－肟法、脲酶－波氏比色法、酶联速率法、红外光谱法。 红外光谱法操作简单，速度快，国外测定DHI就包括MUN指标，国内使用较少。

MUN检测试剂盒一般采用分光光度法检测，试剂使用量大。检测对象为血样或尿样。 牛奶中乳蛋白和乳脂含量高，不能直接使用试剂盒进行检测，需要进行前处理。

发明内容

本发明为了解决现有技术中，牛奶中尿素氮检测过程中存在的操作繁琐、检测成本高、 花费时间长、敏感性和特异性较低的问题，提供一种牛奶中尿素氮检测试剂盒，本发明使用 96孔反应板和酶标仪进行检测，节省试剂、检测通量大，同时还有牛奶处理液，进行样品处 理。本产品使用方便，适合牛奶中尿素氮的大量检测。

本发明提供的牛奶中尿素氮检测试剂盒，组成包括：96孔反应板、浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩 沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ、对照液，所述96孔反应板为96孔平底 带盖酶标板；所述浓缩沉淀剂Ⅰ为亚铁氰化钾溶液，浓度范围为2.12～20.6g/dl；所述浓缩沉 淀剂Ⅱ为乙酸锌溶液，浓度范围5.8～30g/dl；所述缓冲液为乙二胺四乙酸钠缓冲液，浓度范围 为1％～10％，pH值为6.0～7.0；所述酶液为尿酶溶液，浓度范围为5～100U/ml；所述显色剂 Ⅰ为酚或其衍生物与亚硝基铁氰化钾混合溶液，酚或其衍生物浓度范围为0.05％～5％；亚硝 基铁氰化钾浓度范围0.01％～5％；所述显色剂Ⅱ为次氯酸钠溶液，浓度范围为1％～10％；所 述对照液为已知浓度的尿素对照品溶液，浓度范围为0.1～10mg/dl。而且，所述浓缩沉淀剂Ⅰ 为20X浓缩沉淀剂，使用前以纯化水按照体积比1:19的比例稀释，混匀后使用；所述浓缩沉 淀剂Ⅱ为20X浓缩沉淀剂，使用前以纯化水按照体积比1:19v/v的比例稀释，混匀后使用。 上述的百分数均为质量百分含量。

所述的牛奶中尿素氮检测试剂盒的使用方法，步骤如下：

(1)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用 前均须摇匀；所述试剂包括浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显 色剂Ⅱ和对照液。所述的浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ使用前与纯化水按照体积比1:19的比 例稀释。

(2)样品液；

精密量取牛奶样品0.1mL，加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加入0.95mL 稀释后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液。

(3)96孔反应板编号；

取出96孔反应板。预留2个空白孔，编号为微孔1和微孔2。

对照液做5个浓度，每个浓度做2孔平行，将对照液对应微孔按序编号为微孔3～微孔12， 并记录对照液微孔所在位置。

剩余微孔按序编号为微孔13～微孔96，用于检测不同牛奶样品中尿素氮的含量，每个牛 奶样品均需按照(2)处理得到相应的样品液。每个样品液最少做2孔平行，记录不同样品液 对应微孔所在的位置。一个反应板最多可以检测42个不同牛奶样品。

(4)加对照液和样品液；

加入缓冲溶液60μl到96孔反应板中的空白孔；

微孔3～微孔12中分别加对照液10μl、20μl、30μl、40μl、60μl，然后再依次加入缓冲溶 液50μl、40μl、30μl、20μl、0μl，使得每个对照液对应的微孔中液体体积均为60μl。

从微孔13开始，2孔平行，分别加样品液60μl，至所有样品液加样完成；随即加入缓冲 溶液10μl/孔，轻轻振荡混匀，加入酶液40μl/孔轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境 中反应20min。

(5)显色；

加入显色剂Ⅰ100μl/孔，随即加入显色剂Ⅱ50μl/孔，轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃ 避光环境中反应20min。

(6)测定；