[发明专利]一种时间分辨荧光定量检测PCT的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种时间分辨荧光定量检测PCT的试剂盒。

背景技术

降钙素原(PCT)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。PCT具有出现早、半衰期短、不受免疫抑制影响、且在全身和局部感染下都呈现正相关的增长等特点。基于此，PCT较大多数经典的炎症因子(如TNF-a、IL-16、IL-6、CRP等)有更好的敏感性、特异性和实时性，在临床检测和监测有重要的实用价值。

现阶段，临床上PCT的检测方法多见双抗夹心免疫化学发光法、放射性免疫法、酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法等。

双抗夹心免疫化学发光法具有敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的PCT。

放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至PCT抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测PCT的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。

PCT的酶联免疫检测方法是双抗夹心ELISA方法，将一对PCT单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过底物与酶的呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大等特点，不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。

侧向免疫层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素酶的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。

PCT的胶体金免疫层析法通过静电吸附将PCT抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着以存在依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。

PCT的免疫荧光层析技术是将PCT抗体共价结合于荧光微球表面的活性基团(-COOH、-NH₂)上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断检测结果，延续了胶体金免疫层析方法的优势，同时具有高敏感度、完全定量、标记物稳定的优点。在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

发明内容

为了解决现有的几种检测PCT技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种时间分辨荧光定量检测PCT的试剂盒。

本发明提供的时间分辨荧光定量检测PCT的试剂盒，包括荧光微球抗体复合物和免疫荧光试纸卡，其中，

荧光微球抗体复合物：是将PCT单抗标记于稀土荧光微球形成的复合体，将该复合体添加到枪头中并冻干而成，作为检测抗体；

免疫荧光试纸卡包括检测试纸卡，检测试纸卡由样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并贴于衬板上构成；其中，硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有另一PCT单抗，质控线位置包被有羊抗小鼠多抗。

PCT单抗是由PCT抗原免疫小鼠获得的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞产生，因此羊抗小鼠多抗可以与PCT单抗结合。

时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术，是以稀土荧光微球(镧系稀土离子)作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子Stokes位移大，避免了激发光和发射光的重叠二影响结果，而且镧系稀土离子荧光寿命长，可以通过延长检测时间来消除检测物质本底荧光的干扰，提高了灵敏度，另外稀土元素的荧光强度高，同样能够提高检测的灵敏度。常用的稀土荧光微球为EU荧光微球。