[发明专利]一种基因组DNA序列精准编辑方法

权利要求书

1.一种基因组DNA序列精准编辑方法，按如下步骤进行：

1)构建一个两侧由同源序列组成的任意突变基因；

2)以目标位点一侧为靶点设计相应的TALEN或CRISPR/Cas9；

3)将该预先构造好的donorDNA与TELEN或CRISPR/Cas9同时转染到操作细胞内； 导致该基因靶点处双链断开，并且随后部分断端会以donorDNA为模板进行修复；

4)通过单细胞克隆培养与基因测序，筛选出单等位基因修饰的细胞株；

当两个等位基因均发生了预期突变，基因组DNA序列精准编辑即告成功；

所述donorDNA含突变内容和相关基因的同源序列；所述TALEN或CRISPR/Cas9 是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合从而导致靶点处DAN双链断开的质粒； TALEN是一对质粒，CRISPR/Cas9是单质粒。

2.权利要求1所述的方法，步骤2)中，TALEN的其中一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA 覆盖插入特定序列的位点或与欲删除序列部分或完全重叠，使donorDNA模板上不存在 TALEN或CRISPR/Cas9的结合位点。

3.权利要求1或2所述的方法，当步骤4)完成后，如果一个等位基因发生了符合 预期的突变，而另一个等位基因未发生改变，重复进行上述步骤3)和步骤4)，至筛选出 两个等位基因均发生预期突变的细胞株。

4.权利要求1或2所述的方法，当步骤4)完成后，如果发现一个等位基因发生了 符合预期的突变，而另一个等位基因发生了非预期的突变时，针对所突变的等位基因重新 设计TELEN或CRISPR/Cas9，然后重复进行上述步骤3)和步骤4)操作，至筛选出两个 等位基因均发生预期突变的细胞株。

5.一种获得基因组DNA双等位基因相同突变的方法，按权利要求4所述方法操作， 至筛选出两个等位基因均发生相同预期突变的细胞株。

6.权利要求1或2所述的方法，DNA序列精准编辑的位点选自整个基因组任意位点。

7.权利要求1或2所述的方法在基因组DNA序列改造中的应用。

8.权利要求7所述的应用，所述基因组DNA序列改造，是在整个基因组的任意位点 定点并无缝隙地插入或删除基因组中特定的碱基序列，且不留下任何无关的基因或碱基序 列。

9.一种DNA在缺失突变时的自身修复方法，首先利用重叠延伸(overlapextension) PCR技术，获得含相关同源序列和突变内容的donorDNA，然后将其连同与针对该序列设 计的TALEN或CRISPR/Cas9一起转染到操作细胞内，后者导致DNA双链断开，部分断 开处两侧的5’到3’断端将与donorDNA发生退火，并以donorDNA为模板合成延伸，然 后离开donorDNA模板，相互退火在一起，从而即可获得与donorDNA中所设计的突变 内容相同的突变。

10.CD195基因DNA序列精准编辑方法，首先利用重叠延伸PCR技术，获得donor DNA，然后将其与针对CD195基因特定位点设计的TALEN质粒对电转入U87细胞内， 导致欲删除32个碱基序列附近DNA双链断裂，并在自然修复的过程中发生donorDNA 与野生型CD195基因之间同源重组，从而获得CD195delta32突变基因；所述donorDNA 是一段含有CD195delta32的基因片段。