[发明专利]一种基因组DNA序列精准编辑方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基因组DNA序列精准编辑方法。具体涉及联合利用基因打靶技术和传统的同源重组技术，定点并无缝隙地插入或删除基因组中特定的碱基序列的方法。

背景技术：

在基因工程领域，研究人员们一直在试图修饰基因组的碱基序列，以求失活某个基因与获得某个新基因的功能。

大肠杆菌同源重组是20世纪90年代末发展起来的一种新的基因工程技术，可以不必依赖限制性酶切位点，而定点精确地完成诸如片段插入、删除及序列改变等等基因改造。大肠杆菌同源重组技术常用于染色体DNA的靶向修饰-基因敲入与敲除，以及空隙修复(gap-repair)方式获取目的基因。原理是以PCR方法合成两侧50-70bp的短同源序列，然后通过细菌内同源重组将短同源序列间的片段插入基因的目标位置或套取相应的基因目标片段。申请人曾于1999年利用大肠杆菌同源重组技术成功敲除了细菌与铁代谢有关的cyay基因(Lietal.Knock-outofthecyaygeneinEscherichiacolidoesnotaffectcellularironcontentandseneitivitytooxidants.FEBSLetters1999,456:13-6)。

但是，利用同源基因重组技术，突变率非常低，甚至不到万分之一，仅适用于繁殖较快单细胞生物，如细菌，可以利用某种抗菌素的活性进行大量筛选。

基因打靶技术是另一种用于基因组定点改造的技术。近年来有较大发展，如2011年，Daniel等(DanielF,etal.ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes.NucleicAcidsRes2011,39:6315-25)将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合，推出与(ZFNs)同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)。2012年，Jinek等又报道一种更为简单、高效和低成本的基因打靶工具——CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9(CRISPRassociated)靶向基因改造(敲除、敲入)技术(JinekM,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science2012,337(6096):816-21)。

然而，基因打靶技术的发展仅仅局限于提高基因打靶效率，而不能提高基因打靶的精准性以及突变的可控性。即，仅能将打靶的位点定位在某个基因的某个区域(通常为数个或数十个碱基)，而且，突变的内容是随机发生，有时插入了一些碱基，有时缺失了一些碱基，插入或缺失的碱基数目也不能随意控制。无法满足基因工程有时需要精准修饰某个基因的需求。

因此，对基因突变精准定点，并且对突变(删除或插入)的内容实现完全任意可控，对两个等位基因进行同样修饰或改造等DNA序列精准编辑技术的开发，非常有必要。

目前尚未见到有关将同源基因重组技术和基因打靶技术结合，用于对基因组DNA序列精准编辑。由于这两种技术的原理完全不同，而且，依据现有DNA修复的理论知识，即使二者联合，仅能插入某特定序列，却无法删除某特定序列。

发明内容：

本发明的目的是提供一种基因组DNA序列精准编辑技术，实现可精准定点、无缝隙地插入或删除特定的碱基序列。

本发明联合利用基因打靶技术(包括TALEN、CRISPR/Cas9等)和传统的同源重组技术实现了上述发明目的。

所述TALEN或CRISPR/Cas9是本领域公认的普遍熟知的术语，TALEN或CRISPR/Cas9是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合，从而导致靶点处DAN双链断开的质粒。其中，TALEN是一对质粒，CRISPR/Cas9是单质粒。