[发明专利]鉴定纯合型TT51-1和杂合型Bt汕优63的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及转基因检测技术领域，尤其涉及一种基于微滴式数字 PCR鉴定纯合型TT51-1和杂合型Bt汕优63的方法。

背景技术

近年来，水稻、玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植 和生产，截止到2014年，世界范围内已经有27种作物涉及357个转化体在38个不同的国家和 地区获准种植或用作加工原料，种植面积已达1．815亿公顷，年增长率为3-4%，比2013年 的1．752亿公顷增加了630万公顷（James，2014，国际农业生物技术应用服务组织）。随着 转基因事件的不断增加，给世界各国转基因生物安全监管带来越来越大的挑战。2008年我 国启动了转基因生物新品种培育重大专项，加速我国转基因生物的研发进程。经过八年的 潜心研究，在转基因生物新品种培育重大专项的支持下，转基因大豆、玉米、水稻、棉花、小 麦、牛等品种不断出现。2009年，我国植酸酶玉米和转基因抗虫水稻（TT51-1和Bt汕优63）首 次获得转基因安全证书，2014年这3个品种再次获得转基因安全证书。转基因监管是转基因 产业健康发展的重要保障，随着转基因生物新品种培育研究成果产业化进程不断加快，加 强转基因生物安全监管成为我国当前十分紧迫的任务。

转基因产品检测标准物质是转基因生物及其产品成分检测的重要物质基础，在制 备转基因标准物质的程序和环节过程中，原材料纯合度鉴定是制备标准物质的关键环节， 目前美国油脂化学家协会（AOCS）和欧盟标准物质和度量研究所（IRMM）鉴定纯合度的方法 主要是采用传统的育种方式或实时荧光定量PCR的方法（李允静等，2013，中国农业科学）。 同时，研究发现采用传统育种方式，需要通过多年多代自交，才能获得纯合转基因材料，耗 时长，费时费力；而实时荧光定量PCR方法本身误差大，对转基因作物进行纯合度鉴定时，误 差比较大，给结果判定带来很大困难。

数字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，实 现了单分子DNA绝对定量。世界上已经发展了三大数字PCR技术平台：微流体芯片数字PCR、 亲疏水芯片数字PCR和微滴式数字PCR，三种数字PCR技术平台相比较，微滴反应能极大程度 分散反应体系，它可以有效消除抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对检测低含 量目标核酸分子的样品有良好的效果，微滴式数字PCR的灵敏度更高，成本更低更实用。微 滴式数字PCR为食品或饲料样品尤其是转基因食品的检测提供了更为灵敏的方法，也为复 杂食品体系中低含量模板分子的检测提供了一个新的潜在发展方向（DanyMorisset等， 2013，PlosOne）。微滴式数字PCR成功鉴定了转基因抗虫水稻T1c-19和转人乳铁蛋白基因 山羊134的外源基因拷贝数分别为2个拷贝和0.5个拷贝（姜羽，2014，农业生物技术学报）。 斯洛文尼亚科研人员采用微滴式数字PCR建立了欧盟授权的12种转基因玉米品种的多重 PCR定量检测方法（DavidDobnik等，2015，Analyticalchemistry）。

我们希望通过利用微滴式数字PCR技术，建立一种鉴定纯合型TT51-1或杂合型Bt 汕优63转基因抗虫水稻品系的方法，进而为制备标准物质或原材料的鉴定繁殖工作奠定基 础，保障材料背景的真实可靠。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有采用传统育种和应用实时荧光定量PCR方法鉴定转 基因材料纯合度存在的困难，提供一种基于微滴式数字PCR鉴定纯合型TT51-1和杂合型Bt 汕优63的方法，所述的TT51-1是转基因抗虫水稻品种，Bt汕优63是TT51-1同常规水稻品种 珍汕97A杂交后的衍生品种。

本发明的目的是这样实现的：

一、基于微滴式数字PCR鉴定纯合型TT51-1和杂合型Bt汕优63转基因植株的方法（简称 方法）

本方法是：

①收集

采用国家标准《转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定量PCR 方法》（农业部2122号公告—8—2014），

TT51-1引物序列：

TT51-1F：5’-AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG-3’，

TT51-1R：5’-GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA-3’；

TT51-1探针序列：