[发明专利]一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及荧光PCR检测试剂盒领域，特别是涉及一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒。

背景技术

登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起一系列临床症状，包括有生命危险的失血性休克综合征和较少见的伴有肝衰与脑病的急性肝炎。以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于全球热带和亚热带的60多个国家和地区，每年大约超过一亿人受到感染，死亡率高达50％，25亿以上的人受到威胁，该病毒的传播已成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。在大多数国家登革热的死亡率大约为5％，大多发生在儿童和青壮年中。

基孔肯亚病毒属于披膜病毒科的甲病毒属，在疾病流行地区，这种病毒可存在于绿猴、狒狒、黑猩猩、牛、马、猪、兔等多种动物体内，受感染的动物宿主和病人都是传染源。该病毒由受感染蚊子叮咬传播，能引起一种少见的病毒性传染病——基孔肯亚热。基孔肯亚热一般持续五到七天，常会引起严重的关节痛使人失去能力，这种状况最终可以恢复，但剧烈疼痛和恢复缓慢的特点可明显影响人的正常生活和工作。2006年在印度和南亚的一次流行中，不止125万人感染基孔肯亚热病毒。2007年9月，意大利北部通报了由一例输入病例引起的一次基孔肯亚热暴发。基孔肯亚热近年来急剧复苏并扩大了地域范围，突出表明了我们对昆虫传播的新传染病的脆弱性，并强调了作为卫生安全基本要素的持续控制规划的重要性。

基孔肯亚热与登革热的传播媒介相同，流行区域基本相同，临床表现亦类似，与登革热较难鉴别，两者鉴别有赖于实验室特异性检测。

荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前已开发出利用荧光定量PCR技术分别针对上述两种病毒进行的快速检测试剂盒，但是由于是单一检测，两种病毒检测下来，既麻烦又浪费成本。因此在荧光RT-PCR技术的基础上，建立单管联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的方法具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒，所述试剂盒包括针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物以及基孔肯亚病毒探针，所述针对登革热病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对登革热病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对登革热病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对基孔肯亚病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对基孔肯亚病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对基孔肯亚病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述登革热病毒探针的探针序列如SEQ ID No.5所示。

更优选的，所述登革热病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

进一步优选的，所述登革热病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC/HEX、RED610、HEX等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

优选的，所述基孔肯亚病毒探针的探针序列如SEQ ID No.6所示。

更优选的，所述基孔肯亚病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

进一步优选的，所述基孔肯亚病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC/HEX，RED610、HEX等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述荧光报告基团为HEX荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明所提供的试剂盒中，登革热病毒探针上标记的荧光报告基团和基孔肯亚病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同，优选情况下，两种荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。

优选的，所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、RT-PCR试剂、内部对照体系和阳性对照中的一种或多种的组合。