[发明专利]一种提高重组大肠杆菌产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能力的方法

说明书

技术领域

一种提高重组大肠杆菌产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能力的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)是一种由L-丙氨酸与L-谷氨酰胺两种氨基酸 脱水缩合形成的一种二肽，简称丙谷二肽。L-谷氨酰胺作为一种条件必需氨基酸在医药行业 中应用极其广泛。L-谷氨酰胺可作为糖异生和尿素合成的原料，神经递质的前体物质，同时 还是体内生化代谢途径的重要中间体。由于具有不同于L-谷氨酰胺的理化性质，丙谷二肽克 服了L-谷氨酰胺的溶解度低、热不稳定性等缺点，因此常常被用作L-谷氨酰胺的替代品以注 射液的形式而应用于临床。

目前主要通过化学合成法来生产丙谷二肽，化学合成法通常需要添加与去除有毒的保护 基这一过程，该方法通常存在合成过程复杂、生产成本高、易生成副产物、目的产物提纯困 难、合成条件苛刻、所用试剂有害等缺点，所以化学合成法不能大规模应用于商业领域。针 对上述现状，本实验室率先在国内开展了有关微生物酶法产丙谷二肽的研究。来源于S. siyangensis的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-aminoacidesteracyltrasferase,AET)能以丙氨酸甲 酯盐酸盐和谷氨酰胺为底物催化生成丙谷二肽。实验室前期已经构建了含α-氨基酸酯酰基 转移酶编码基因SAET的表达载体。

尽管我们研究室目前具有丙谷二肽的生产菌种，并且已经可以实现丙谷二肽的微生物酶 法制备，但我们仍面临着丙谷二肽生产菌种不稳定、产量低、底物转化率低等问题。有研究 报道，二肽是一些环状抗生素的类似物，二肽在胞内的过量积累会影响细胞自身的生长代谢， 从而使菌种变得不稳定。除此之外，对于二肽生产菌种而言，二肽自身在胞内的积累也不利 于酶催化反应的正常进行。KazuhikoTabata等人研究了E.coli自身基因组中的多药外排转运 蛋白家族，该蛋白家族位于细胞膜上，可以专一有效的将一些寡肽从胞内转运至胞外。经过 34种蛋白的筛选试验，有四种转运蛋白是具有转运丙谷二肽能力的，而ydeE又是这四种中 转运效果最为理想的。

针对我们研究室面临的问题并参考相关报道，可以通过ydeE基因与SAET基因的共表达 来改善丙谷二肽生产菌种的稳定性，并进一步提高菌种的产量与底物转化率。

发明内容

本研究室目前已经具有了可以生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌以及若干相关 的大肠杆菌基因敲除菌，但是这些生产菌种仍面临一些缺陷。本发明要解决的问题主要是通 过多药外排转运蛋白编码基因ydeE与氨基酸酯酰基转移酶编码基因SAET在大肠杆菌中共表 达，从而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产菌种的生产能力，底物利用能力与自身稳定性。

本发明通过将ydeE与SAET共表达，多药外排转运蛋白可以将氨基酸酯酰基转移酶编码 催化产生L-丙氨酰-L-谷氨酰胺专一有效的从胞内转运至胞外，从而可以显著提高底物转化 率与产量，工业应用前景广阔。

本发明所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将ydeE以及SAET重组到一个载体上，或 者，将含有ydeE的重组质粒以及含有SAET的重组质粒共同转化至微生物细胞中，实现两种 基因的共表达。

本发明所述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产方法主要通过以下两个阶段实现：(1)将重组 大肠杆菌接种于特定的发酵培养基上，经特定条件下的培养以期获得大量菌体；(2)将上述 所获得的菌体当做粗酶源，添加入特定条件下的底物体系中进行酶催化反应从而获得L-丙 氨酰-L-谷氨酰胺。

本发明中的两种基因均含有独立的启动子。SAET含有磷酸盐调控的启动子phoC，从已 有的重组载体上酶切获得。ydeE含有其自身的启动子，通过PCR扩增获得。

为了实现两种基因的共表达，有两种策略：一是将ydeE和SAET整合到同一个载体上， 使用各自的高效启动子表达；另一个是把含有ydeE的重组质粒和含有SAET的重组质粒共转 化同一宿主，使用双质粒表达系统在宿主细胞中表达。

作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pAMP、pUC19、pET-28a、pET-21a、 pKYP10、pBR322等。