[发明专利]一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒

权利要求书

1.一种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有如下 的组分：

1)A号液：所述的A号液为稀释液；

2)B号液：所述的B号液为分离液；

3)C号液：所述的C号液为洗涤液；

4)D号液：所述的D号液为培养液；

5)E号液为CAPRI体外处理试剂，其中包括Ⅰ液，为rhIL-2和IFN-γ的混合液；Ⅱ液为 rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ的混合液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的A号液为pH7.2～7.4的PBS释液液。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的B号液为由聚蔗糖和泛影葡胺配制 成的密度为1.077±0.001的分层液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的C号液为质量比为0.9％生理盐水。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的E号液中Ⅰ液为15000-25000U/ml rhIL-2和15000-25000U/mlIFN-γ的培养液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的E号液中Ⅱ液为27000-35000U/ml rhIL-2、500-600ng/mlrhIL-15、7500-12500U/mlrhIL-18和27000-35000U/mlIFN-γ的 培养液。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的D号液为培养液，其组成包括：氯化 钾28-32mg/ml、氯化钙38-42mg/ml、硫酸镁11-13mg/ml、氯化钠48-52mg/ml、磷酸二氢钾28- 32mg/ml、碳酸氢钙11-12mg/ml、氨基酸13mg/ml、维生素21-22mg/ml、微量元素0.93mg/ml、 白蛋白43-47mg/ml、胰岛素7.8-8.2mg/ml、亚油酸0.38-0.42mg/ml、油酸4.8-5.2mg/ml、谷 胱甘肽2.3-2.7mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸14.5-15.5mg/ml、葡萄 糖14.8-15mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的方法，包括如下 步骤：

1)取抗凝外周加入A号液，混匀得混合液；

2)在离心管中加入B号液；

3)将步骤1)的混合液小心沿管壁加入B号液液面上；

4)以2500-3000转/分离心至离心管中由上至下细胞分为四层；

5)收集第二层细胞，用C号液混匀后，以1800-2000转/分离心，弃去上清留沉淀重新用C 号液悬浮，洗涤得所需外周血单个核细胞(PBMC)；

6)将分离的部分外周血单个核细胞用D号液调整细胞浓度2×10⁶，加入到抗CD3抗体和 Retronectin-T100B包被的细胞培养瓶中；

7)在37℃、CO₂浓度为5％细胞培养箱中培养2.5-3.5小时后，加入E号液试剂Ⅰ，调整细胞 因子rhIL-2和IFN-γ终浓度分别为750-1250U/ml、750-1250U/ml；

8)继续培养2.5-.35小时后加入步骤5)分离的剩余的PBMC，混匀后继续培养，然后吸取 收集培养的细胞，离心清洗后，悬浮培养在D号液中，加入E号液试剂Ⅱ，调整细胞因子rhIL- 2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ浓度分别为450-580U/ml、9-10ng/ml、120-200U/ml和500- 600U/ml；

9)继续培养48小时后换液，补加D号液和E号液，继续培养24小时后倍量换液，继续培养 48小时后收获冻存。