[发明专利]一种制备低聚果糖的方法及其酶制剂

说明书

本发明属于应用酶工程领域，具体涉及一株重组基因工程菌及其制备低聚果糖的方法。所述重组菌是通过将黑曲霉来源的果糖基转移酶编码基因fru3基因在芽孢杆菌宿主细胞中进行表达获得，所述重组菌还包含能使果糖基转移酶基因fru3基因在地衣芽孢杆菌中表达的启动子P_shuttle‑09。此外，本发明利用疏水性组合溶剂对果糖基转移酶的保护性，通过在低聚果糖生产过程添加疏水溶剂的方式，提高酶的耐热性，从而提高底物蔗糖溶液浓度，制备出的低聚果糖无需后期脱色、精制、浓缩等工艺。利用这一技术，大大缩短了低聚果糖生产工艺路线，减少了设备投入，降低了生产成本。

技术领域：

本发明属于应用酶工程领域，具体涉及一株重组基因工程菌及其制备低聚果糖的方法。

背景技术：

低聚果糖(Fructooligosaccharides),简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为:G-F-Fn，n＝1-3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由蔗糖和1-3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖及其混合物。工业上一般由蔗糖经果糖基转移酶 (Fruetosyltransferase，EC 2.4.1.9，FTS)的转糖基作用而生成低聚果糖，低聚果糖是一种保健食品，具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，其作为功能性因子被广泛应用于食品中，如奶制品、饮料、糖果糕点、肉类加工品等。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。

目前低聚果糖的制备方法有两种：菊粉水解，蔗糖合成。因利用菊粉酶水解菊粉生产低聚果糖有产品成分复杂，工艺繁琐，成本高等缺点，所以大多数厂家逐渐改用果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖。

酶的来源及制备方法。果糖基转移酶存在于植物以及微生物中。据文献报道, 植物中的果糖基转移酶催化活性很弱,产率低,且受到季节限制,而来自微生物的果糖基转移酶比植物的催化活性高,且耐高温,可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应,使用方便。具有果糖基合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。不同微生物来源的果糖基转移酶的相对分子质量、米氏常数、最适作用温度、最适pH及基质特异性方面存在一定差异。如来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的果糖基转移酶的分子质量为52kDa,最适温度为55℃,最适pH 6.5,而来源于微杆菌 (Microbacterium sp.)的果糖基转移酶的分子质量46kDa,最适温度48℃,最适pH 6.0。再比如来源于黑曲霉的果糖基转移酶在不同pH下,转果糖基活性/水解活性不同，在pH 4.0～5.0和pH 8.0时低聚果糖产量最高,而在pH 5.0～8.0范围内的水解酶活力最高。目前，常被用来作为工业化生产的菌种有黑曲霉(Aspergillusniger)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等。目前，国内外工业化生产的方法主要是通过选出高活性菌种后破碎菌体、菌体和酶分离制备液体酶制剂,进行低聚果糖的生产,工艺路线较长,设备多,而且通常制备的低聚果糖产品外观色泽差或呈褐色,产品应用范围受到限制。进一步通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的果糖基转移酶普遍活力不高。而基因工程手段是提高果糖基转移酶活性的有效途径之一。

但是，受果糖基转移酶的酶学性质的影响，普遍耐热性差，反应温度不能过高，一般低于50℃，在此条件下，底物蔗糖的浓度最大为50％(w/v)，通过微生物的果糖基转移酶来进行低聚果糖的工业化生产，其理论的最大产率仅为55～ 60％(YunJW.Fructooligosaccharides-occurrence,preparation,and application. EnzymeMicrob Tech,1996,19:107-117)。这一工艺后的半成品还需要经脱色、精制、浓缩等工艺，这些工艺存在操作复杂，消耗大，生产成本高等问题。