[发明专利]一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

提取液，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、EDTA和疏基乙醇混 匀后制成，置于100mL试剂瓶中；

试剂一，液体×1瓶，-20℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、6-磷酸果糖和 UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中；

试剂二，蔗糖溶液×1瓶，4℃保存，由一定量的蔗糖溶于蒸馏水后制成，置于10mL试剂 瓶中；

试剂三，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的氢氧化钠溶于蒸馏水后制成，置于2mL试剂瓶 中；

试剂四，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的盐酸溶于蒸馏水后制成，置于25mL试剂瓶中；

试剂五，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的间苯二酚溶于乙醇和蒸馏水后制成，置于6mL 试剂瓶中。

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：

所述提取液中的Tris-HCl缓冲液的体积为100mL，物质的量浓度为100mM，pH=7.0，氯 化镁的质量为203mg，EDTA的质量为58mg，巯基乙醇的体积为140uL；

所述试剂一中的Tris-HCl缓冲液的体积为5mL，物质的量浓度为50mM，pH=7.0，氯化镁 的质量为10mg，6-磷酸果糖的质量为15.2mg，UDPG的质量为9mg；

所述试剂二，即所述蔗糖溶液的体积为10mL，浓度为1mg/mL，其中蔗糖的质量为10mg， 蒸馏水的体积为10mL；

所述试剂三中的氢氧化钠的质量为0.16g，蒸馏水的体积为2mL；

所述试剂四中的盐酸的体积为7.5mL，蒸馏水的体积为17.5mL水；

所述试剂五中的间苯二酚的质量为6mg，乙醇的体积为5.7mL，蒸馏水的体积为0.3mL。

3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的蔗糖磷酸合成酶活性测定方法，其特征在于， 基于分光光度法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、 冰；

步骤2样品测定的准备：

按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆；然后采用离心 机8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3分光光度计或酶标仪的预热；

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零；

步骤4蔗糖磷酸合成酶活性的测定操作；

取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管；

2）在测定管中加入10μL样本和45μL所述试剂一，在对照管中加入10μL样本和45μL蒸馏 水，在标准管中加入45μL蒸馏水和所述试剂二，在空白管中加入55μL蒸馏水；

3）分别将上述4支EP管混匀，25℃准确水浴10min；

4）水浴后分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入15μL所述试剂三；

5）将上述加入所述试剂三的4支EP管分别在沸水浴中煮沸10min，然后冷却；

6）在冷却后的测定管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在对照管中加入210 μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在标准管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在 空白管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五；

分别将上述加入所述试剂四和所述试剂五的4支EP管混匀，沸水浴30min，冷却；

8）在上述冷却后的4支EP管中各取200μL物质至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下 测定各管吸光值；

步骤5蔗糖磷酸合成酶活性的计算；

1）按照蛋白浓度计算：

蔗糖磷酸合成酶活性（U/mgprot）=[C_标准管×V₁×（A_测定管-A_对照管）÷（A_标准管-A_空白管）]÷（V₁× Cpr）÷T=100×（A_测定管-A_对照管）÷（A_标准管-A_空白管）÷Cpr；

2）按照样本鲜重计算；

蔗糖磷酸合成酶活性（U/g鲜重）=[C_标准管×V₁×（A_测定管-A_对照管）÷（A_标准管-A_空白管）]÷（W×V₁÷V₂）÷T=100×（A_测定管-A_对照管）÷（A_标准管-A_空白管）÷W；

其中，C_标准管=1000μg/mL，表示标准管浓度；

V₁=0.01mL，表示加入反应体系中样本体积；

V₂=1mL，表示加入提取液体积；

A_测定管表示测定管中物质的吸光值；

A_对照管表示对照管中物质的吸光值；

A_标准管表示标准管中物质的吸光值；

A_空白管表示标准管中物质的吸光值；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本鲜重，单位为g；

T=10min，表示反应时间。