[发明专利]一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种蔗糖磷酸合成酶活性 测定试剂盒及其方法。

背景技术

蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的 贮存形式之一。蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸 酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要 途径。

目前市面已有的检测蔗糖磷酸合成酶活性的方法是间苯二酚显色法。其原理是样 本中蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应呈现的颜 色变化的深浅与蔗糖磷酸合成酶活性高低成正比。该方法是市面上公认的唯一一种检测蔗 糖磷酸合成酶活性的方法，但是该方法仍存在很多不足：

1、不能适用于检测蔗糖含量较高的样本，样本中含有的蔗糖会对测定该酶活性产生很 大的影响，造成测定结果不准确。

2、反应总体积为2-3mL，各种试剂加入的量较大，尤其是UDPG的浓度达到10mM以 上，该试剂价格昂贵，总体成本较高。

3、试剂种类过多，操作过程过于繁琐。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明旨在提供一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒 及其方法，可快速准确的对蔗糖磷酸合成酶活性进行测定。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：

提取液，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、EDTA和疏基乙醇混 匀后制成，置于100mL试剂瓶中；

试剂一，液体×1瓶，-20℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、6-磷酸果糖和 UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中；

试剂二，蔗糖溶液×1瓶，4℃保存，由一定量的蔗糖溶于蒸馏水后制成，置于10mL试剂 瓶中；

试剂三，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的氢氧化钠溶于蒸馏水后制成，置于2mL试剂瓶 中；

试剂四，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的盐酸溶于蒸馏水后制成，置于25mL试剂瓶中；

试剂五，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的间苯二酚溶于乙醇和蒸馏水后制成，置于6mL 试剂瓶中。

进一步的，所述提取液中的Tris-HCl缓冲液的体积为100mL，物质的量浓度为 100mM，pH=7.0，氯化镁的质量为203mg，EDTA的质量为58mg，巯基乙醇的体积为140uL；

进一步的，所述试剂一中的Tris-HCl缓冲液的体积为5mL，物质的量浓度为50mM，pH= 7.0，氯化镁的质量为10mg，6-磷酸果糖的质量为15.2mg，UDPG的质量为9mg；

进一步的，所述试剂二，即所述蔗糖溶液的体积为10mL，浓度为1mg/mL，其中蔗糖的质 量为10mg，蒸馏水的体积为10mL；

进一步的，所述试剂三中的氢氧化钠的质量为0.16g，蒸馏水的体积为2mL；

进一步的，所述试剂四中的盐酸的体积为7.5mL，蒸馏水的体积为17.5mL水；

进一步的，所述试剂五中的间苯二酚的质量为6mg，乙醇的体积为5.7mL，蒸馏水的体积 为0.3mL。

蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈 现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

一种采用上述试剂盒且基于分光光度法的蔗糖磷酸合成酶活性测定方法，包括以 下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、 冰；

步骤2样品测定的准备：

按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆；然后采用离心 机8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3分光光度计或酶标仪的预热；

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零；

步骤4蔗糖磷酸合成酶活性的测定操作；

1）取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管；