[发明专利]黄曲霉毒素M1的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种黄曲霉毒素 M1的快速检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素污染源极广，无法完全消除黄曲霉毒素污染。哺乳动物摄入被黄曲霉 毒素污染的饲料或食品后，在体内可被羟化而生成黄曲霉毒素M1。奶牛吃了被黄曲霉毒素 污染的饲料，所产奶中就会有黄曲霉毒素M1，人们每天都会食用的牛奶，如果其中的黄曲霉 毒素M1含量过高，就会造成对人体健康的危害。由于黄曲霉毒素M1具有强的致癌作用，世界 卫生组织制定食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，美国联邦政府有关法律规定人类 消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能300μg/kg。我国《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》发布的国家标准中规定食品中黄曲霉毒素M1在乳及乳 制品中的限量为0.5μg/kg。欧盟国家规定原奶、热处理奶及加工奶产品中黄曲霉毒素M1限 量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中黄曲霉毒素M1限量为0.025μg/kg。因此，建 立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素M1的检测方法具有重要意义。

目前国内外研究主要有色谱法、化学发光法和酶联免疫法等。色谱法对操作技术 要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生化试剂，而且这些生化 试剂很容易失活等不足。文献MaterialsScienceandEngineeringC33(2013)2229– 2234公布了一种基于黄曲霉毒素M1核酸适体的黄曲霉毒素M1电化学测定法，该法选择性 和检测灵敏度均高，只是电极组装较为复杂，需专业人才才能完成。发明内容

本发明提供一种简单、快速、灵敏的高选择性黄曲霉毒素M1的快速检测方法。

本发明采用的技术方案：一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法，包括步骤：

（A）黄曲霉毒素M1核酸适体APT与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；

（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链选择性 地与黄曲霉毒素M1反应释放出单链信号探针ssDNA；

（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA 水解成单核苷酸，从而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；

（D）利用黄曲霉毒素M1核酸适体-黄曲霉毒素M1结合体不能诱导铜离子还原成近红外 荧光铜纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能诱导生成具有强荧光的近红外铜纳米簇，检测体 系中荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。

所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子迅速还原成近红外 荧光铜纳米簇的+4价硫无机化合物还原剂，例如亚硫酸氢钠。步骤（D）的检测例如包括依次 先后向体系中加入铜离子溶液和维生素C溶液，反应后生成近红外荧光铜纳米簇。

所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。

所述的单链信号探针sSDNA为5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。

本发明的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交；当有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链 与黄曲霉毒素M1反应释放出ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)，Apt-黄曲霉毒素M1 和ssDNA。Apt-黄曲霉毒素M1不能诱导铜离子还原生成近红外荧光的铜纳米簇，对测定无干 扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b. 用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA。单链信号探针ssDNA不水解 （水解速度非常慢），此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光的铜纳米簇的ssDNA，通过检 测体系荧光强度，从而可以测定真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。由于消除体系中背景荧光 的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。

本发明另外提供了一种检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素M1 核酸适体、可与黄曲霉毒素M1核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切 酶、铜离子还原检测体系。

所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。