[发明专利]棒曲霉素的检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种棒曲霉素的 检测方法及检测试剂盒。

背景技术

棒曲霉素是由霉菌产生的一种有毒的真菌代谢产物。能够产生棒曲霉素的霉菌， 主要包括青霉属、曲霉属、丝衣霉等霉菌，这些霉菌，可广泛地感染多种水果、蔬菜、粮食、饲 料和中药材，导致这些作物及其制品受棒曲霉素污染。如受这些霉菌感染的苹果，距其霉烂 斑点3厘米处的果肉中，仍可检出棒曲霉素。棒曲霉素对热稳定，100℃加热15分钟仍然不 能破坏其结构，且在酸性溶液及有机溶剂中能长期保存。棒曲霉素曾因为其抑制多种菌生 长而被用作抗生素，它具有引起抽搐、肠道出血、肺部出血、肾脏损害等急性毒性，棒曲霉素 对神经系统、呼吸系统、泌尿系统、免疫系统和生殖系统等都具有较强的毒性。同时具有基 因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前检测棒曲霉素的方法有：色谱法、色谱联用技术、酶联 免疫法等。这些方法检出限低、精密度高，但操作复杂、检测成本高。建立一种快速、简单、低 成本的棒曲霉素检测方法有重要意义。

中国专利CN104593374A公开了一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体，其可 用于棒曲霉素的检测，但未见用于棒曲霉素的检测的进一步应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种检测棒曲霉素的方法。

本发明采用的技术方案：一种检测棒曲霉素的方法，包括如下步骤：

（A）使棒曲霉素核酸适体（Apt）与单链信号探针ssDNA（Sp）杂交，形成杂交链；

（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有棒曲霉素存在时，杂交链选择性地与 棒曲霉素反应释放出单链信号探针ssDNA；

（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，选择性地催 化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；（D）利用棒曲霉 素核酸适体-棒曲霉素结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号 探针ssDNA(Sp)能诱导生成具有强荧光的近红外银纳米簇，检测体系中荧光强度，从而测定 待测样品中的真菌毒素棒曲霉素的含量。

所述棒曲霉素核酸适体为

5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTT GACTATCAGTCGTGC-3’。

所述可与棒曲霉素核酸适体杂交的单链信号探针DNA为5’- CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。

本发明的检测原理如下：先让Apt与Sp杂交（下划线部分）；当有棒曲霉素存在时， 杂交链与棒曲霉素反应释放出Sp；体系中存在Apt-Sp(剩余的)，Apt-棒曲霉素和Sp。Apt- 棒曲霉素不能诱导银离子还原生成近红外荧光的银纳米簇，对测定无干扰；杂交链可能有 干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，选 择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA未水解而保留下来；此时 体系中只留下可诱导生成近红外荧光的银纳米簇的Sp，以波长为585nm的光为激发光，测 定体系荧光发射（610-800nm）光谱的荧光强度，依据荧光强度与棒曲霉素的量的关系，从 而可以测定真菌毒素棒曲霉素的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的 灵敏度和精度。

本发明还提供了一种检测棒曲霉素的试剂盒，其至少包括：棒曲霉素核酸适体、可 与棒曲霉素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检 测体系。

所述棒曲霉素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTAC ACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3’。

所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。