[发明专利]病毒性出血性败血症病毒可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法

说明书

本发明公开了一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法，所述引物的序列如下：VHSV281‑F：5’‑FITC‑CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT‑3’，5’端标记FITC；VHSV281‑R：5’‑biotin‑TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA‑3’，5’端标记biotin。检测方法，包括以下步骤：①RT‑PCR扩增；②PCR产物试纸条检测试验。本发明的方法具有操作便利、特异性强、灵敏度高，结果直观、稳定、可靠、对环境友好等多项优点，适合口岸检疫实验室进行VHSV的快速筛查，提高了出入境口岸的鉴定工作效率，能更好地适应进出口贸易快速通关的要求，所使用的RT‑PCR产物检测试纸条是个通用型试纸条，可以广泛应用于ＰＣＲ诊断试剂的开发，该检测方法无需电泳仪、凝胶成像仪等仪器设备投入，应用成本低，对于ＰＣＲ检测方法在基层实验室的推广应用将有着巨大的推动作用。

技术领域：

本发明涉及一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法。

背景技术：

病毒性出血性败血症（viralhaemorrhaic septicaemia，VHS）是由弹状病毒引起鲑、鳟、狗鱼和大菱鲆等数十种鱼类的一种烈性传染病，表现为出血性败血症，致死率达90%~100%。本病主要流行于北半球，是世界动物卫生组织（OIE）要求须申报的疫病，我国将其列为二类疫病。VHSV基因组为一段单链负链RNA，其线性基因组编码5个蛋白，包括：核衣壳蛋白(N 蛋白)，两个结构蛋白(M1 和M2 蛋白)，糖蛋白(G 蛋白)和RNA 聚合酶(L蛋白)。VHSV粒子长约180nm，宽约70nm。其基因组长度约12k个碱基。

目前国际上检测病毒性出血性败血症病毒通常采用的方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法、反转录聚合酶链反应法以及酶联免疫吸附试验。细胞培养分离VHSV法结果可靠，但是检测周期长，不适用于快速鉴别诊断;传统的病毒细胞培养法和血清学法均受限于各自的特点，检测费时费力，难于满足快速检测的需要。因此，探讨其快速诊断方法，对病毒性出血性败血症病毒的疫情监控及流行病学调查，从而采取相应的防治措施具有重要意义。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可以快速诊断病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的方法。本发明在病毒性出血性败血症病毒5’端设计一对引物，建立VHSV可视化核酸试纸条检测技术，并对其反应条件进行优化，该方法快速、灵敏、具有良好的特异性。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组，所述引物的序列如下：

VHSV281-F：5’-FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3’，5’端标记FITC；

VHSV281-R：5’-biotin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3’，5’端标记biotin。

同时，本发明还提供一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测方法，包括以下步骤：

①RT-PCR扩增

提取VHSV总RNA，进行RT-PCR扩增，具体参数为：45℃ 10 min进行逆转录；95℃ 10min热启动；然后进行35 次PCR循环（94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s 循环）；72 ℃ 7min；4℃保温；

②PCR产物试纸条检测试验

取5 μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加2～3滴缓冲液，10 min后观察质控线、检测线，判读出阴、阳性的结果；所述的缓冲液是RT-PCR产物检测试纸条配套的缓冲液。

在检测带区域出现明显红色条带为阳性，否则为阴性。