[发明专利]一种克隆酶供体片段及其制备方法

说明书

本发明公开一种克隆酶供体片段及其制备方法，该供体片段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。该序列蛋白经凝血酶酶切后可以获得具有生物学活性的克隆酶供体片段单体。该克隆酶供体片段具有互补效率高、稳定性好、易于偶联小分子化合物、抑制效果好等特点，且可大规模获得，纯化方便。能应用于小分子化物的检测。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体说是属于均相酶免技术领域的克隆酶供体片段，及其基因。

背景技术

利用重组DNA技术制备β-半糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体(enzymeacceptor， EA)，小片段称为酶供体(enzyme donor，ED)。两个片段本身均不具酶活性，但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性。利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(cloned enzyme donor immune assay,CEDIA)。

CEDIA的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶。加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定。

但是该技术存在以下几个技术难点，导致该技术未能大范围应用，大大限制了其应用领域。

其一，偶联小分子问题，一般来说，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸的ε-氨基或者末端氨基)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)。野生的ED(CNBr2)与EA(M15或M112)具有较高的互补活性(非-专利文件1:Welply JK,Fowler A V,Zabin I,.beta-Galactosidase alpha-complementation.Overlappingsequences.[J]. Journal of Biological Chemistry,1981,256(13):6804-6810.)，但是其上的位点并不适合于偶联小分子物质，例如专利US4708929指出通过该片段上的氨基，羧基，巯基，与小分子化合物偶联后，其所得的产物与EA片段的互补效率大大降低，因此若不对该ED片段进行合适的改造，恐怕不能用于直接地偶联小分子。

其二，由于ED片段的分子量较小，约有90个氨基酸组成，其分子量只有10KDa左右，因此，如果直接用于表达，很容易在表达的过程中就进行降解，使得难以得到完整的ED片段。为此有以下两种不同的策略去改进，其一是利用多肽合成的方法进行获得ED片段，例如专利US7135325B2，利用多肽合成的方法合成了一系列小的ED片段，这些ED片段具有一定的互补活性。但是利用多肽合成的方法对于小分子多肽的合成上具有一定的优势(小于 50个氨基酸)，正如该专利所合成的那样(30～50aa)，但随着多肽分子量的增加，其合成难度以及成本均急剧上升。而较好的ED片段所含的氨基酸数目为应该是60～100个为宜，因为如果ED片段过于的小，其互补效率也会下降，且该片段的稳定性也会受到影响。另一种方法是在表达方式上进行改善，例如专利US4708929就是通过ED与EA共表达的方式获得EA，有学者则是通过ED与Trx蛋白融合表达的方式获得(非-专利文件2:李黄金,陈伟,赵林, 等.β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析[J].广东药学院学报, 2010(04):412-415.)，也有学者则是通过胞外表达的方式获得ED(非-专利文件3:许淑芬,刘磊,孙牧男,等.大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定[J].吉林大学学报：医学版,2010,36(1):40-44.)。但是无论用现有的哪种表达方式，其所获得的ED表达量均很低，很难满足产业化的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的克隆酶供体片段存在表达量低，稳定性差，偶联易失活等缺点，提供一种稳定性好，偶联方便，表达量高的克隆酶供体片段。