[发明专利]一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法

说明书

本发明公开了一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法，首先利用生物信息学比对木聚糖酶XynZF‑2基因序列与耐热木聚糖酶EvXyn11基因序列的同源性，通过N‑端替换将XynZF‑2的N‑端48个氨基酸替换成木聚糖酶EvXyn11N‑端的34个氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，进而在XynZF‑2酶C端继续引入二硫键Cys38‑Cys191、α‑螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入糖基化修饰位点E42N和F17S，构建多位点突变杂合酶XynZL，期望杂合酶XynZL的热稳定性有所改善。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法。

背景技术

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化水解木聚糖的一类多功能酶的总称。木聚糖酶广泛分布于自然界中，如动物、植物和微生物等，且种类繁多，应用领域广泛。目前，微生物来源的木聚糖酶研究报道很多，研究得最多的是来源于细菌和真菌的木聚糖酶。其中，细菌可以产生碱性和酸性木聚糖酶，而真菌可以产生碱性木聚糖酶。目前，木聚糖酶主要由真菌和细菌等微生物发酵生产而来。

随着生物技术的不断发展，木聚糖酶的研究开发备受关注。在工业应用方面，木聚糖酶具有很大的工业应用潜力和价值，它是一种重要的工业酶制剂，广泛应用于食品加工、酿造、纸浆漂白、制药、饲料添加剂、医药、纺织、生物转化等领域。木聚糖酶在使用过程中对外界物化条件极为敏感，在工业进程中的高温、重金属离子、氧化剂和极端pH等条件下，都会使木聚糖酶构象遭到破坏，从而限制了酶的应用环境。因此，提高木聚糖酶稳定性已成为研究者广泛关注的焦点。目前，通过生物信息学分析比对木聚糖酶晶体结构发现，氢键、离子键数目、盐桥、N端以及α-螺旋处区域等与木聚糖酶的稳定性密切相关。很多人以此为依据，通过基因工程和酶工程等手段研究木聚糖酶的稳定性，并取得了良好的成果。

目前已经发现影响木聚糖酶热稳定性的诸多因素，但国内外对于木聚糖酶分子热稳定性突变位点的报道相对较少。一般来说所有的二硫键在蛋白质折叠和稳定性方面都起着关键的作用，且与蛋白质的热稳定性密切相关。N端二硫键的引入对酶热稳定性的影响国内外已有报道，但C端引入二硫键对木聚糖酶热稳定性有无影响，未见报道。

随着蛋白质组学技术不断发展，人们发现蛋白质糖基化对蛋白质构象的稳定有一定的作用。糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。目前，对于蛋白质糖基化修饰研究主要是N-糖基化和O-糖基化。研究发现，N-糖基化多发生在Asn-Xaa-Ser/Thr序列的Asn残基上，O-糖基化多发生β-转角区域。另外，通过糖基化修饰来提高木聚糖酶稳定性的研究相对较少，因此，有一定的探索空间。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法，首先利用生物信息学比对木聚糖酶XynZF-2基因序列(GenBank AccessionNo.JQ700382)与耐热木聚糖酶EvXyn11基因序列(GenBank AccessionNo.EU591347)的同源性，通过N-端替换将XynZF-2的N-端48个氨基酸替换成木聚糖酶EvXyn11N-端的34个氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，进而在XynZF-2酶C端继续引入二硫键Cys38-Cys191、α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入糖基化修饰位点E42N和F17S，构建多位点突变杂合酶XynZL，期望杂合酶XynZL的热稳定性有所改善。

其技术方案如下：

一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、木聚糖酶结构分析