[发明专利]用于高通量测序的DNA建库方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于高通量测序的DNA建库方法，特别是用于高通量测序的cfDNA建库 方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，也是全球发病和死亡的主要原因。根 据世界卫生组织公布的数据表明，2012年约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死 亡。根据全国肿瘤登记中心发布的2012年数据，中国每年新增病例约350万，约占全球发病 的五分之一；癌症死亡人数约为250万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。尽管我国在肿 瘤的手术、化学药物治疗、放射治疗和生物治疗技术上都取得了很大的进展，但人口基数大 使我国成为世界上癌症死亡数最高的国家。

肿瘤本质上是基因病。肿瘤的发生、发展、转移、恶化都与基因突变有着密切联系。 肿瘤的发生是各种环境的和遗传的致癌因素引起的基因突变和多种突变长期积累的结果。 突变的发生和积累导致了原癌基因的激活和抑癌基因的失活，引起DNA损伤修复和/或细胞 周期和/或编程性死亡机制的失调，继而引起细胞的转化。转化的细胞在与正常体细胞生存 竞争的过程中，不断进化，最终变成具有无限增殖潜力的癌细胞，从而导致肿瘤的发生。在 癌细胞成克隆性的无限扩增过程中，其中一些克隆会获得新的附加突变，选择性地形成具 有不同特点的亚克隆(异质化)，从而获得浸润和转移的能力。近年来，随着医药科学技术的 不断发展，以及“精准医学”概念的提出，癌症的治疗观念正在发生着由非特异性向个体化 的根本性转变。更有益于节省费用、减少对病人的毒副作用和提高疗效。

高通量测序技术的兴起以及测序成本的大幅降低为个体化医疗的实现提供了极 大的便利。通过对癌症患者活检样本提取的DNA进行文库的构建，测序及生物信息分析就可 快速得出患者的准确突变信息。根据突变信息对患者进行分组，提供针对性的治疗及疗效 评估。高通量测序技术中文库的构建一般分为DNA的随机打断、末端修复、接头连接、连上接 头的DNA片段的PCR扩增及质控。IonAmpliSeq技术是目前较为先进的与半导体测序相配套 的建库技术，该技术通过超高多重PCR，可以在短时间内同时扩增几千种PCR片段、分析几百 个基因，使用IonAmpliSeqLibraryKit2.0可以利用低至10ng的样品成功建库并用于高 通量测序。然而，对血浆cfDNA进行高通量测序时，由于血浆中cfDNA含量很低，可获得的 cfDNA量极少，尤其是在可取血量较少时，所提取的cfDNA常常无法达到10ng，因此，需要开 发一种可利用较少血液来建库的方法。

发明内容

本发明提供了一种用于高通量测序的DNA建库方法，特别是用于高通量测序的 cfDNA建库方法，该DNA建库方法可以降低初始DNA的用量，利用较少的DNA成功建库，以通过 高通量测序对DNA进行分析。本发明的DNA建库方法可以利用低至1ng的DNA样品进行建库以 进行高通量测序。

本发明的用于高通量测序的DNA建库方法，是在IonAmpliSeqLibraryKit2.0 的建库方法基础上，对PCR扩增条件和试剂使用量进行了优化，其具体步骤如下：

1)多重PCR

将分离纯化的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：

多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行23个循环，每个循环为99℃15s、60 ℃4min，然后保持在10℃；

2)引物部分裂解

将1μlFuPaReagent加入到步骤1)得到的PCR产物中混匀后，在PCR仪中依次按下 述条件运行：50℃10min，55℃10min，60℃20min，然后保持在10℃；

3)接头的连接和纯化

向步骤2)得到的反应产物中加入2μl的7.5XSwitchSolution、1μl的Barcode Adapter、1μlDNALigase，在PCR仪中依次按下述条件运行：22℃30min，72℃10min，然后保 持在10℃；