[发明专利]一种检测藤壶幼虫早期附着程度的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及在主要的海洋污损真核生物中对污损早期藤壶幼虫 附着的测定。

背景技术

海洋污损生物又称海洋附着生物，是生长在船底、下水管道、石油平台、渔业的网具及 一切海中人为设施表面的有害生物。其中藤壶是最主要的海洋污损之一，藤壶(Barnacle) 又称为“马牙”或“蚵沏仔”，属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、围胸 目(Thoracica)、蔓足类动物，目前发现的藤壶共有8科约541种，其中我国约有110种。

藤壶以其特殊的形态结构、生活史和种群生态成为最主要的海洋污损之一，主要生活在 潮间带及朝下带，附着栖息在海水中固定或浮动的硬物上，若附着在网箱上，不仅堵塞网箱 网衣，易造成养殖的环境变差，而且增大网箱衣阻力，易发生大潮汛期鱼体擦伤；若附着在 船底，增加船舶阻力，使航速降低；若附着在浮标上，能降低浮力。而目前有效果的防污涂 料会对海洋生态系统造成一定得影响，因此，针对藤壶可以试从它生长发育阶段的幼虫附着 期进行有目标的防除。而想要在藤壶早期附着时进行测试其附着率，分子标记方法成为首选 的技术手段，避开生物形态结构差异的干扰,直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传 信息,定量描述、分析附着情况，提高了早期鉴定主要海洋污损生物物种的准确度和效率。

藤壶的附着测定至少在如下几个方面非常重要：(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损 早期(肉眼可见藤壶生长之前)抑制藤壶幼虫附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内藤 壶纯培养体系中幼虫附着率与实际海水中幼虫附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的 机制研究：有时需要测定在某个特定的涂层表面藤壶的附着生长被抑制是由于幼虫附着被抑 制还是附着后生长被抑制。

中国专利(CN101654704A)报道了一组引物用来区分不同藤壶的亚种分类，可以区分白 脊藤壶和纹藤壶。本专利涉及的引物可以用来测定更多藤壶亚种的幼虫附着。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在海洋污损中对污损早期藤壶幼虫附着的测定。测定的特异 性是由藤壶特异性引物来保障的。该特异性引物时基于藤壶的18SrDNA设计的，其序列为 AmpR1：5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTCGTTG-3’。它与核糖体基因18SrDNA的通用引物F566 (5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’)一起使用可以确保藤壶基因扩增的特异性。 扩增结果可以通过qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量测定。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于分子标记技术，在主要海洋污损真核生物中检测藤壶幼虫附着程度的方法，该 方法包括以下步骤：

⑴藤壶特异性引物的设计；

⑵污损早期(肉眼可见附着藤壶之前)海水污损样本的采集和基因组提取；

⑶利用藤壶特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定藤壶幼虫的附着。

而且，藤壶特异性引物设计方法如下：比较主要海洋污损真核生物的18S核糖体基因序 列，找出来藤壶的特异性SNP(单核苷酸多态性)位点。该位点作为引物的3’最末端位置 使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配 (弱错配：A-C,T-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)，与非靶序列也形成一个错 配(强错配：T-T，T-C,A-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)。这样一来，引物 与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列 有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得藤壶特异性引物。

而且，上述方法设计的藤壶特异性引物之一为AmpR1：5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTC GTTG-3’。该引物与通用引物F566：5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’一起使用可 以完成早期污损样品中藤壶幼虫存在与否的测定判断。

⑴引物设计