[发明专利]has-miR-29b-3p的检测

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及快速检测指标技术领域，特别涉及一种检测 microRNAhas-miR-29b-3p的试剂盒及其方法。

背景技术

血流感染是感染性疾病最严重的临床表现形式之一，患者发生血流感染，会导致 住院时间的延长以及住院费用的增加，且病死率高。血流感染的诊断传统通过血培养来鉴 定，但具有需要的血样量多和出报告的时间长等缺点。

人体的巨噬细胞具有通过识别、吞噬并最终清除细菌的作用，在宿主抵御病原菌 感染的过程中发挥巨大作用。has-miR-29b-3p是巨噬细胞在受到细菌感染时会高表达的一 种microRNA，并且在血培养阳性患者血清中可检测到其较对照组升高。

发明内容

本发明的目的是提供检测has-miR-29b-3p的试剂盒，建立一种检测has-miR-29b- 3p的方法。该方法有快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：

一种检测has-miR-29b-3p的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性扩 增has-miR-29b-3p的特异性引物对，所述引物为具有SEQIDNo：1的连续核苷酸序列和具 有SEQIDNo：2的连续核苷酸序列；

所述试剂盒中还包括RNA逆转录引物，其序列为SEQIDNo：3。

SEQIDNo：1:5’GGGTAGCACCATTTGAAA3’

SEQIDNo：2:5’TGCGTGTCGTGGAGTC3'

SEQIDNo：3如下所示：

5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACACTG3’

优选的技术方案是：所述试剂盒还包括与引物序列构成PCR反应体系的Pfu缓冲 液、dNTPs、MgSO₄、PfuDNA聚合酶、模板DNA、荧光染料；所述PCR反应体系的终浓度组成为：

优选的技术方案是：所述荧光染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、PLUS染料、ResoLight染料、SYTO9染料、SYBRgreen染料；所述dNTP混合液包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP的混合液。

本发明的第二方面是提供一种前述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)血清总RNA的提取：包括取血样离心后，取上清，加入TRIzolLSReagent试剂 和冰醋酸，剧烈振荡混匀进行匀浆；孵育后加入氯仿抽提，取水相加入异丙醇沉淀RNA，离心 沉淀RNA，去除上清液后加入乙醇清洗沉淀RNA，最后空气干燥，加入无RNA酶的水溶解RNA备 用；

(2)逆转录：在SEQIDNo：3的反转录酶的作用下及RNA酶抑制剂存在的条件下反 应，反应条件16℃30min,42℃40min,85℃5min,最后在冰上待用或-20℃保存；

(3)荧光定量PCR(RT-PCR):使用SEQIDNo：1的引物和SEQIDNo：2的引物进行荧 光定量PCR反应，

(4)建立标准曲线，按绝对定量方法对结果进行分析。

在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲液 (buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl₂、PfuDNA聚合酶。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转 录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡 脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸 之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物 不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

本发明的采用实时荧光定量PCR检测患者血清标本中has-miR-29b-3p表达水平， 从而快速筛查血流细菌感染患者。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：