[发明专利]一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法

权利要求书

1.一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，其特征在于所述方法为敲除E.coli K5的waaR基因，获得E.coli K5突变株；将E.coli K5突变株接种至发酵培养基，在30-37℃、120-200rpm培养24-33小时，发酵结束后将发酵液在8000-10000rpm离心10-30min，弃去菌体，得发酵上清液，将发酵上清液用体积浓度1.0-2.0％的过氧化氢水溶液脱色，4-25℃过夜后，离心去除沉淀，取上清液用质量浓度50-70％饱和硫酸铵进行盐析，4-25℃存放过夜；次日8000-10000rpm离心10-30min，沉淀物用200-3000Da透析袋进行透析脱盐，浓缩并冻干，得到降低分子量的肝素前体；所述发酵培养基组成为：十二水合磷酸氢二钠10-25g/L，磷酸氢二钾0.2-2g/L，氯化铵2-6g/L，葡萄糖10-30g/L，盐酸硫胺素5-100mg/L，5-20mL/L痕量元素，pH 7.0～7.2，溶剂为水；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁2-20g/L，氯化钙0.2-4g/L，七水合硫酸锌0.2-10g/L，四水合硫酸锰0.1-2g/L，五水合硫酸铜0.2-2.0g/L，四水合钼酸铵0-0.2g/L，十水合四硼酸钠0-0.2g/L，溶剂为1-5mol/L HCl水溶液。

2.如权利要求1所述降waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，其特征在于所述敲除E.coli K5waaR基因的方法为：将质粒pKD46电转入E.coli K5细胞，在含50-100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，获得含pKD46的E.coli K5细胞；以质粒pKD4为模板，在引物P1、P2作用下，PCR合成两端为waaR基因同源臂，中间为抗性标记的打靶片段，获得打靶DNA；将打靶DNA与含pKD46的E.coli K5感受态细胞进行电转化，并在含50-100μg/mL卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选，获得敲除waaR基因的E.coli K5突变株；

P1：

TTATTTACGGTAATATTTTCGGCAAAGATAACACACTCCTGCAATGAGTCCTGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC；

P2：

GTGGACTCATTTCCTGCCATAGAGATAGATAAAGTTAAAGCCTGGGATTTTAGGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。