[发明专利]一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法

说明书

本发明公开了一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，获得细菌突变株；将细菌突变株经发酵培养，取培养液分离纯化，得到降低分子量的多糖；本发明提供了一种通过基因工程手段改造产荚膜多糖细菌，以获得更低分子量的多糖产物，该方法可适用于E.coli，所述方法为敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，实现保持多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。

(一)技术领域

本发明涉及一种降低多糖分子量的方法，通过基因工程手段敲除细菌waaR基因，通过多糖电泳、GPC检测验证，发现突变菌株合成的多糖分子量比改造前低，实现了在保持多糖产量的同时进一步获得更低分子量产物的目的。

(二)背景技术

肝素(heparin)是一种含硫酸酯的粘多糖，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，具有抗凝血和抗血栓作用。肝素虽然广泛应用于抗凝血，但是会对人体产生一定的副作用，例如造成出血并发症以及血小板减少等症状，这在一定程度上限制了它的应用。而低分子量的肝素(low molecular weight heparin，LMWH，分子量小于8000Da，平均大小为5000Da)不仅保持了抗凝血的功能，而且产生的副作用也大大减小。由于分子量低以及多分散性程度的下降，低分子量肝素表现出了更好的药代动力学特征，半衰期变长，生物利用率高，使用也更安全，更重要的是大大降低了肝素药物易导致出血、血小板减少和骨质疏松等副作用。因此，低分子量肝素已经逐渐替代传统的肝素，更广泛的应用于临床治疗，目前低分子肝素类在肝素类药物用量比重中占了80％以上。

从制备方法来看，低分子量肝素可以通过物理法，化学法以及酶法得到。物理分离法是从未分级的肝素(Unfractionated Heparin，UFH)中分离得到低分子量肝素，但是该方法需要添加有机溶剂，会影响产物的质量。而且在UFH中，低分子量肝素含量有限，因此该方法不适合应用于低分子量肝素的大规模生产。利用过氧化氢和亚硝酸化学解聚生产低分子量肝素已经广泛应用于工业生产，但是仍然存在很多缺点，例如造成环境污染，过程不易控制，氧化剂与heparin分子硫酸基团之间的剧烈反应会造成低分子量肝素药用活性的降低等。Escherchia.coli K5的荚膜多糖中有结构为(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)n，其二糖骨架结构与脊椎动物中的肝素类似，但未硫酸化，也没有将葡糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，故又称为肝素前体(heparosan)。1992年，Nielesen等应用肝素酶I解聚高分子量肝素成功制得LMWH，证明了应用酶法制备低分子量肝素的可行性。相对于化学法，酶法具有反应条件温和，特异性强，环境友好型等优点，目前酶法制备仍处于实验室研究阶段，但以heparosan为合成前体进行化学或酶法修饰得到特定功能肝素及其衍生物是越来越受到关注。通过不同的解聚方法制成的不同品种的低分子肝素，其药物动力学特性和抗凝谱有不同程度的差别，在临床上不能相互代替。目前，已开发出十几种低分子肝素产品，如已在临床应用的依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、舍托肝素钠、亭扎肝素钠、瑞肝素钠等。

大肠杆菌细胞表面有脂多糖，肠杆菌共同抗原以及荚膜多糖或者K抗原。这些多糖分子之间相互作用，共同维持细胞表面多糖组织结构的稳定。waaR基因编码α-1,2-糖基转移酶，能够将第三个葡萄糖残基(GLcIII)添加到外核。waaR基因功能缺失的突变株合成的外核将缺失GicIII和HepIV末端残基片段，影响脂多糖结构的稳定。E.coli K5多糖通过其还原端的脂质替代物与外膜磷脂酸分子结合连接于细胞表面。磷酸二酯键的不稳定会导致heparosan从细胞表面脱落，富集于培养基中。目前已有研究证明waaR基因的缺失不会影响E.coli K5多糖的合成，但对于具体缺失后是否会对其多糖产量和多糖物质结构变化的深入研究未有相关报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，即利用Escherichia coli K5 △waaR制备低分子量heparosan的方法，实现保存多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。

本发明采用的技术方案是：