[发明专利]一种Cerrena来源的漆酶的高效表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种Cerrena来源的漆酶的高效表达方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

漆酶(EC.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，对各种酚类、芳胺及其衍生物都具有催化 氧化作用，并且在小分子助剂存在的情况下可以氧化降解一些不含酚羟基的酚类化合物。1883 年由日本人吉田首次从日本漆树的汁液中分离而得名，漆酶自发现以来一直是纺织、化学、 生物学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，在纸浆生物漂白、有机染料脱色、工业废水 处理和高分子催化合成等方面表现出很大的研究价值和应用潜力。

目前认为，漆酶是一种普遍分布于植物、昆虫、真菌和细菌中的重要酶，大部分漆酶来 自植物和真菌。真菌漆酶具有来源广泛、单电子氧化还原电位高、催化活性强等特点，而且 既能催化底物的氧化聚合又能对木质素进行催化降解，比植物漆酶具有更广泛的应用前景和 价值。Cerrena来源的漆酶产量高，且比多数其他真菌来源的漆酶基因的热稳定性更好，对某 些有机物如乙醇的抗性更强。因此，进行Cerrena来源的漆酶的大量表达对扩展漆酶的应用 具有重要作用。

但是，利用丝状真菌生产漆酶还存在一些问题，如发酵周期长、培养基要求高、酶活力 低，菌丝在发酵罐中易受高剪切力的损伤。解决的办法只有通过克隆出漆酶基因然后进行异 源表达以提高产量。此外，通过异源表达还可以利用定点突变来提高漆酶的理化性质如较高 的氧化还原电位，更接近于中性的最适反应pH值及较高的热稳定性等。

众所周知，基因的异源表达受到宿主、载体、启动元件等多种因素的影响。有些虽有蛋 白条带但没检测不到酶活等。因此，如何实现Cerrena来源的漆酶的异源表达、活性表达、 高效表达是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种Cerrena来源的漆酶的活性表达、高效表达方法， 是将核苷酸序列如SEQIDNO.1的漆酶在毕赤酵母菌中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母是P.pichiaGS115。

在本发明的一种实施方式中，所述表达是以pPIC9K为表达载体进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法，具体是将核苷酸序列如SEQIDNO.1的漆酶基 因克隆到表达载体pPIC9K上得到重组载体，然后再转化到毕赤酵母P.pichiaGS115中进行 表达。

本发明的第二个目的是一种毕赤酵母基因工程菌，所述工程菌表达核苷酸序列如SEQID NO.1的漆酶。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌，是以P.pichiaGS115为宿主、 pPIC9K为载体表达SEQIDNO.1的漆酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法：(1)化学合成法合 成SEQIDNO.1所示的基因片段；(2)将基因片段连接到pPIC9K上得到重组载体 pPIC9K-Lcc3’；(3)将重组载体线形化后电转入P.pichiaGS115，筛选阳性克隆并验证，即 得到毕赤酵母基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供利用所述毕赤酵母基因工程菌发酵生产漆酶的方法，是将基 因工程菌在BMGY培养基中，温度30℃、转速220rpm下培养至OD2～6，离心收集菌体， 重悬于BMMY培养基中，在温度30℃、转速220rpm下培养，添加甲醇和Cu²⁺诱导表达， 发酵上清即含有漆酶。

在本发明的一种实施方式中，所述甲醇的添加方式为每24h添加0.5％的甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述0.5％的甲醇，是指每100mL发酵液中添加0.5mL甲 醇。

本发明的有益效果：

本发明实现了Cerrena来源的漆酶的活性表达、高效表达。而且本发明使用毕赤酵母表 达系统来表达漆酶Lcc3’，还具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、 可高密度发酵等许多优点。

附图说明

图1：甲醇诱导毕赤酵母表达外源基因Lcc3和Lcc3’的胞外上清漆酶活力曲线；

图2：重组漆酶Lcc3和Lcc3’的SDS-PAGE图。

具体实施方式

重组漆酶酶活测定