[发明专利]黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法

权利要求书

1.一种黄颡鱼Cyp24a1蛋白，其特征在于：所述黄颡鱼Cyp24a1的氨基酸序列为：由SEQID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；其中，所述黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C₂₆₀₂H₄₁₁₂N₇₀₄O₇₄₀S₂₆，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。

2.编码权利要求1所述蛋白的黄颡鱼Cyp24a1基因的开放阅读框ORF，其特征在于：所述开放阅读框ORF的序列为SEQ ID No.1所示。

3.包含权利要求2所述ORF的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列，其特征在于：所述的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列为SEQ ID No.2所示。

4.获取权利要求3所述黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)肝脏组织总RNA的提取；

2)cDNA第一链的合成；

3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增；

4)RACE-PCR扩增；

5)RACE片段的分离与回收；

6)连接和转化；

7)将阳性克隆菌液送出测序；

8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。

5.根据权利要求4所述黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)肝脏组织总RNA的提取

总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：

(1)从-80℃冰箱中取出100mg的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮并磨成粉末；

(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAiso Plus裂解液，然后迅速把组织粉末加入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温静置5min；

(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中；

(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液乳化呈白色，在室温静置5min；

(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；

(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地混匀，在室温静置10min；

(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；

(8)小心弃去上清，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁；

(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清；

(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3～5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；

(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱中保存；

2)cDNA第一链的合成

(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：

(2)4℃条件下反应2min；

(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：

(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存；

3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增

根据转录组的数据设计引物对

Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；

Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC；

PCR扩增的反应条件为：

95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5分钟；PCR产物连入pMD19-T载体中，转化E.coli DH5α，涂布含氨卞青霉素的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，对PCR阳性克隆产物进行测序；

4)RACE-PCR扩增

4.1 RACE引物设计

根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物；

5’RACE引物

Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT

Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG

3’RACE引物

Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT

Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG

4.2 RACE-Ready cDNA准备

(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-Ready cDNA反应液

(2)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷却后用14000×g离心10s；

(3)在5’-和3’-RACE-Ready cDNA反应液中都加入下列试剂

(4)混匀试剂，瞬时离心；然后在PCR仪器中进行反转录反应，

反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并在-20℃中保存；

4.3 RACE-PCR扩增

(1)RACE-PCR反应液的配制

(2)混匀试剂，瞬时离心；

按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s，72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应25个循环；最后72℃延伸10min；

(3)用Tricine-EDTA buffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACECyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20个循环；

5)3’/5’RACE片段的分离与回收

(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小，放入到1.5mL离心管中；

(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μl Buffer NT1；

(3)在50℃条件下，约5～10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；

(4)将PCR Clean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(5)在Clean-Up柱中加入700μl Buffer NT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(6)11000×g离心1min，确保Buffer NT3完全清除；

(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μl Buffer NE，室温静置1min，11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段；

6)连接和转化

6.1连接

(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：

(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上；

6.2转化

(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；

(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；

(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μl IPTG和40μl X-gal，并混匀；

(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素的LB筛选平板上，37℃正面放置30min，带菌液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12～16h；

7)将阳性克隆菌液送出测序

(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min震荡培养4～6h；

(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；

(3)挑选若干个阳性克隆菌液500μl进行测序；

8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。