[发明专利]用于检测黄曲霉毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

本发明公开了一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的特异性单克隆抗体,它是由杂交瘤细胞株AFB1/3B9所分泌的，所述的杂交瘤细胞株AFB1/3B9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201558。本发明还公开了检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种毒素，而且具有很高的识别灵敏度，本发明的酶联免疫方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体和一种用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌的次级代谢产物，是一类结构相似的化合物，都含有二呋喃环和香豆素，其有20多种，目前分离鉴定的有12种，常见的主要为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2。黄曲霉毒素主要污染农作物和饲料。使用了污染黄曲霉毒素的饲料，可引起猪只产死胎和木乃伊胎，并可引起鸡产蛋率下降和口腔溃疡。经研究发现，黄曲霉毒素具有明显的“三致”作用，人误食了污染了黄曲霉毒素的食物会引起中毒，甚至死亡。

目前检测黄曲霉毒素的方法主要为仪器方法和免疫学方法。仪器方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高，而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测黄曲霉毒素的残留，ELISA方法更具优势。而制备较高灵敏度的抗体是ELISA方法的根本，只有制备出较高灵敏度的抗体，才能制备出具有竞争性的ELISA试剂盒。王雄等(2008)利用ELISA方法检测饲料中的黄曲霉毒素B1，抗体的最低检测限为0.05ng/mL，标准曲线的线性范围为0.05～2.00ng/mL，其抗体灵敏度不高，且使用的样品前处理过程较为复杂，不便于在基层使用；王磊等(2012)制备了抗黄曲霉毒素B1抗体，该抗体的IC50值为2.58ng/mL；李敏等(2015)采用异源包被的抗原建立了ELISA方法，其抗体灵敏度由1.6ng/mL提高到了0.3ng/mL，同时成功建立了ELISA方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体，以提高识别的灵敏度和特异性；本发明的另一个目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫方法及试剂盒，以提高检测的灵敏度、准确度和精密度，同时简化操作程序。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株AFB1/3B9所分泌的。

所述的杂交瘤细胞株AFB1/3B9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201558。

所述的单克隆抗体，它是以黄曲霉毒素B2(AFB2)与羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)反应生成黄曲霉毒素B2肟(AFB2O)，AFB2O再与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得到的。本发明优选的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白(KLH)。

所述的单克隆抗体可用于建立检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法。

所述的单克隆抗体可用于制备检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶联免疫试剂盒。

一种检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗体的制备，间接竞争ELISA方法的建立，其步骤如下：

(1)将AFB2与CMO反应得到的半抗原AFB2O；