[发明专利]一种大花蕙兰人工种子制作方法

权利要求书

1.一种大花蕙兰人工种子制作方法，其特征包括以下方面：

a）类原球茎诱导：以大花蕙兰无菌苗茎尖为材料接种于类原球茎诱导培养基生长，诱导形成类原球茎；

b）类原球茎增殖：步骤a）得到的类原球茎在固体增殖培养基生长20-30天后，转移至液体培养基进行增殖生长，增殖之后的大花蕙兰类原球茎用于人工种子制作和包埋；

c）大花蕙兰人工种子制作与萌发：将步骤b）得到的类原球茎切分成单个类原球茎，采用海藻酸钠溶液和CaCl₂包埋，凝固形成的人工种子经过无菌和温室萌发；

所述步骤a）中类原球茎诱导为将无菌苗茎尖接种到1/2MS+NAA0.5-2.0 mg•L^-1+椰乳50- 150ml•L^-1+蔗糖30-40g•L^-1＋琼脂5.5-7.0 g•L^-1+活性炭1.0 g•L^-1的培养基上诱导形成类原球茎；

所述步骤b）中大花蕙兰类原球茎的固体增殖的步骤为：挑选生长状态接近的类原球茎，在无菌条件下称重，接种到1/2MS固体培养基添加NAA 1.0-2.5 mg•L^-1+6-BA 0.5-1.0mg•L^-1生长20-30天，然后转移至液体培养基，原球茎的液体增殖的步骤为：选用容积为100-500ml的三角瓶为培养容器，将类原球茎接种到1/2MS+NAA2.0-2.5mg L^-1+6-BA 0.5-1.0mg•L^-1液体培养基中，每瓶接种2.0g，液体生长20天的类原球茎用于人工种子包埋；

所述步骤c）大花蕙兰人工种子制作与萌发包括以下步骤：

将海藻酸钠溶解于1/2MS培养液中，配制成质量浓度为2%-3%的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌；在无菌条件下，选择饱满硬脆的绿色类原球茎，分离直径5.0mm左右的颗粒置于海藻酸钠溶液中，然后用滴管吸取含有类原球茎的溶液滴入作为凝聚剂的2%CaCl₂溶液中，形成直径8.0mm左右的凝胶颗粒，20min后取出，制作成类原球茎人工种子；以无菌水冲洗三次，平置于纯琼脂培养基的培养皿中；此外，人工种皮中需添加NAA0.5-2.0mg•L^-1+6-BA0.5-1.0 mg•L^-1；

挑取未萌发的类原球茎，将类原球茎接种到铺有干燥滤纸的培养皿或铺有以无菌水湿润的滤纸的培养皿中，恒温培养20天；以不加有机元素的1/2MS＋NAA0.5-2.0mg•L^-1＋6-BA1.0-2.0 mg•L^-1配置2%的海藻酸钠溶液，包埋上述类原球茎，得到的人工种子置于纯琼脂培养基的培养皿中，在培养室中培养，萌发率达到90％以上。