[发明专利]一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系、构建方法及应用

权利要求书

1.一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系的构建方法，其步骤如下：

(1)合成厌氧启动子序列，将该厌氧启动子序列与pUC19表达载体分别双酶切后相连， 获得重组载体pUC19+promoter；

(2)以Vitreoscilla基因组为模板，设计引物，通过PCR反应获得3’端含甘氨酸链接基 团和凝血酶切割位点基因的透明颤菌血红蛋白基因序列vgb’；

(3)将步骤(2)得到的基因序列vgb’与步骤(1)得到的重组载体pUC19+promoter分别双 酶切后连接，获得重组载体pUC19+promoter+vgb’；

(4)以pET20b(+)-PelC-CD为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨 酸标签基因的嗜热碱性果胶裂解酶基因CD；

(5)将步骤(4)得到的裂解酶基因CD与步骤(3)得到的重组载体pUC19+promoter+vgb’ 分别双酶切后连接，获得重组载体pUC19+promoter+vgb’+CD；

(6)将重组表达载体pUC19+promoter+vgb’+CD转化到大肠杆菌表达宿主E.coliBL21 (DE3)中，得到可视化标签融合蛋白表达体系。

2.如权利要求1所述的一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系的构建方 法，其特征在于：厌氧启动子的核苷酸序列为 TTAAAAGTATTTGAGTTTTGATGTGGATTAAGTTTTAAGAGGCAATAAAGATTATAATAA。

3.如权利要求1所述的一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系的构建方 法，其特征在于：重组载体pUC19+promoter+vgb’中promoter+vgb’基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.如权利要求1所述的一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系的构建方 法，其特征在于：重组载体pUC19+promoter+vgb’+CD中融合蛋白vgb’+CD基因的核苷酸序列 如SEQIDNO.2所示。

5.一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系，其特征在于：是由权利要求1 ～4任何一项方法制备得到。

6.权利要求5所述的透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系在蛋白纯化中的 应用。

7.一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白的制备方法，其特征在于：是将权利要 求1～4任何一项得到的可视化标签融合蛋白表达体系先用小体系LB培养基活化后再转入 到大体系LB培养基扩增16～24h；然后在密闭条件下，摇床转速调到100～120r/min，温度降 到25℃，开始表达融合蛋白，表达时间24～36h；4000r/min～6000r/min离心收集菌体，用pH ＝7～8的缓冲液溶解菌体，通过超声破碎、Ni-NTA亲和层析、透析获得融合蛋白，其氨基酸 序列如SEQIDNO.3所示。