[发明专利]一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合蛋白表达体系、构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种透明颤菌血红蛋白可视化标签融合 蛋白表达体系、构建方法及其在蛋白纯化中的应用。

背景技术

在蛋白质结构组学研究中，获得高度纯化的蛋白质是非常必要的，在蛋白质的结 构功能和相互作用的研究中，常常需要纯度高、折叠正确的蛋白质。所以怎样可以纯化出来 源成分单一的目标蛋白一直以来是大家关注的问题。在20世纪，融合标签技术是最新发展 起来的一种基因重组技术，其主要技术是在靶蛋白基因组的5’端或者3’端插入某种标签的 编码基因，构建融合的基因组序列。然后通过适宜的宿主菌进行表达，表达的融合蛋白将通 过融合的标签与固相的特异性介质进行结合，从而大大提高了蛋白质纯化的效率，也使得 蛋白纯化技术变得更加简便。近几年，随着蛋白标签技术的发展，其功能也变得越来越多样 化，但主要用于蛋白的纯化。

在对融合蛋白的研究分析中发现，融合蛋白的标签对蛋白的纯化效率有很大的影 响。和传统的蛋白纯化技术相比，融合蛋白标签技术使得蛋白纯化速率加快，蛋白含量增 加，不仅节约了时间和成本，而且提高了效率。同时在对蛋白结构和功能的研究中得知，融 合标签在对靶蛋白的理化性质和结构方面也产生了不可忽视的作用，主要表现在三个方 面：增加了融合蛋白的含量、增加了融合蛋白的溶解度、促进了融合蛋白分子的折叠。

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)是一种目前研究较为深入的 氧结合蛋白，广泛的存在于动植物和微生物中，也是目前发现最早，对其结构和功能研究的 最为透彻的原核生物血红蛋白。透明颤菌血红蛋白由两个完全相同的亚基和两个b型血红 素组成，分子量为16kDa，每个亚基具有146个氨基酸，具有过氧化物酶活性。透明颤菌血红 蛋白不管是在原核生物中还是在酵母中进行表达，都能够增加细胞的浓度和生长速度，使 得融合蛋白的产量有所提高，增加抗生素的产量，尤其是在缺氧条件下，生物修复功能将会 有很大的提升。正是由于VHb分子本身所具有的这种优越性，使它被作为一种可视化标签得 到了应用。

透明颤菌血红蛋白是一种厌氧性蛋白，但是它的表达能够促进细菌的生长，而且 研究发现，这两者之间呈现一定的对应关系。当氧气浓度很低时，大概小于5％，透明颤菌血 红蛋白的表达量相比之下反而会得到了提高，同时细菌的生长也相应的的得到了提高。当 透明颤菌血红蛋白的表达量达到一定程度时，细菌的生长速度不再增加，保持在一个相应 的水平。透明颤菌血红蛋白的过量表达会对宿主菌产生毒性，可能会导致宿主菌体的死亡， 从而使得透明颤菌血红蛋白的生物功能得不到发挥，所以在宿主菌体中，透明颤菌血红蛋 白的表达必须控制在一个相应的水平范围之内。透明颤菌血红蛋白基因有一个很强的启 动子(其天然启动子为厌氧启动子)，如果将透明颤菌血红蛋白基因连接到一个高拷贝的质 粒中，毫无疑问将会使得透明颤菌血红蛋白过量表达，从而对宿主菌体产生毒性，这反而不 利于透明颤菌血红蛋白的生物功能研究。所以将透明颤菌血红蛋白基因连接到低拷贝的质 粒中，或许会避免上面出现的问题。从而使得透明颤菌血红蛋白能够足量表达，而且有利于 促进宿主菌体的生长，从而不至于出现透明颤菌血红蛋白的过量表达使得蛋白表达的负担 太重，形成了非活性二聚体，使宿主菌的折叠酶结构发生错误，从而对宿主菌体的生长有着 破坏性的影响。

在本发明中我们应用了透明颤菌血红蛋白作为一种融合标签，把它的基因和一种 来源于热梭菌Caldicellulosiruptorbescii6275的无色的碱性果胶酶基因CD进行融合， 表达一种融合蛋白，融合蛋白将会带上红色，使得无色的碱性果胶酶CD也会带上红色，这样 在后续的纯化过程中会非常容易跟踪和检测到碱性果胶酶CD。透明颤菌血红蛋白是一种 16kDa小分子量蛋白，溶解度极高，不管是在原核生物中还是在酵母中进行表达，都能够增 加细胞的浓度和生长速度，使得融合蛋白的产量有所提高。正是由于透明颤菌血红蛋白分 子本身所具有的这种优越性，使它被作为一种可视化标签得到了应用。碱性果胶酶CD分子 量为22kDa，性质清楚，结构简单，但由于是一种无色蛋白，在后续的纯化过程中，很难跟踪 和监测，因而使得蛋白纯化过程变得困难。所以我们设想用透明颤菌血红蛋白作为融合标 签，和碱性果胶酶CD融合表达，使得碱性果胶酶CD也带上红色，方便原本无色蛋白分离和纯 化。

发明内容