[发明专利]一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了属于生物技术领域的一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包含RPA冻干颗粒，缓冲液，醋酸镁，RPA反应引物，RPA反应探针。本发明利用RPA技术建立日本血吸虫的检测方法，其灵敏度与特异性与Q‑PCR法相当，远远高于Kato‑Katz法、毛蚴孵育法、ELISA以及IHA，整个反应时间在10‑20min内完成，结果判定仅需通过荧光曲线的改变来判定。该检测试剂盒具有灵敏，特异，结果判定简便，快捷等优点。不仅适用于床边诊断而且可以用于现场研究，环境评估。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

血吸虫病是世界上第二大寄生虫病，是一种人畜共患的寄生虫病，流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区，是世界上重要的公共卫生问题之一。现主要存在6种寄生于人体的血吸虫，其中我国流行的日本血吸虫病对人体健康危害最严重，且防治难度最大。日本血吸虫病不仅影响个人健康，而且影响整个血吸虫病流行区域的经济发展。我国已于2004年将其列为乙类传染病，与传染性非典型肺炎、艾滋病处于同等重要的防治位置。

我国的血吸虫病分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省的433个县(市、区)，共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，说明我国的血吸虫病防治工作还任重道远。

国家对血吸虫病的防治非常重视，每年针对血吸虫患者及疫水要进行大量的资金投入用于血吸虫的防控。目前用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超声诊断等。传统病原学诊断方法是诊断血吸虫病最为可靠、经典，是判断血吸虫病患病与否的金标准，尤其Kato-Katz涂片粪检法以及毛蚴孵育法。Kato-Katz法是从患者粪便中查找血吸虫虫卵，较为费时、费力，且疫区群众依从性下降，且易造成漏检。MHT法包括尼龙袋法、顶管法、集孵法与促孵法等，该方法检出率高于常规方法，但用时太长，工作量大，且同样存在不能早期诊断和群众依从性差等问题。免疫诊断方法具有较高的敏感性以及疫区群众的依从性较高等优点，已为广大专业人员和疫区群众所接受，并在对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用，已形成了皮试、尾蚴膜试验、环卵沉淀试验(COPT)、间接血凝试验(IHA)、多种酶联免疫吸附试验(ELISA)和直接免疫检测等方法。COPT，对于非疫区健康人群具有较高的敏感性和较低的假阳性率，但对疫区的反复化疗的人群其敏感性为72％，这一方法的NPV较高，超过87％，而PPV较低32％-70％，这一方法费时且相对复杂，需要显微镜。IHA，仍是社区诊断常规的方法，用于化疗人群的筛选，同Kato-Katz法及MHT法相比，其敏感性高，简便，快速。然而在反复化疗的地区，这一方法的PPV较低，低于37％，其敏感性从69-100％，其特异性从35-94％，此外这一方法同卫氏并殖吸虫有64-84％的交叉反应。这限制了其应用。ELISA法包括了Dot-ELISA，SPA-ELISA等，其敏感性从65-100％，但是大多数报道的特异性均小于60％，ELISA的NPV较高，超过88％，但是大多数报道的PPV非常低。血吸虫病的超声诊断是非损伤性诊断方法，操作简便，能准确发现肝脏血吸虫病的病理改变，可评估病情的严重程度。在现场短期内可检查大量人群，立即可获结果，若使用标准化方法，具有可比性。但是对于早期血吸虫病人无效。