[发明专利]晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法

权利要求书

1.一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因非诊断目的的检测方法，其特征在于，利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况；

所述的利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC，步骤如下：

1)采集晚期癌症患者外周血：肘正中静脉5ml；

2)将外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA，稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；

3)利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；

4)过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器(3)，PBS冲洗2-3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上；

所述的鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞，步骤如下：

1)向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；

2)PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭30min；

3)加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；

4)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；

5)Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；

6)PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜(7)置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；

7)荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；

所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：

1)外周血过滤后，从过滤装置中取下滤器(3)，打开并移走滤器上口(6)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜(7)，放置在载玻片上，适当干燥后在显微镜下观察,证实存在CTC；

2)制作薄层切片：

A、脱色：将上述带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下，置于95％酒精与100％二甲苯按体积比1:1混匀的脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；

B、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用吸水纸包裹；

C、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；

D、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；

E、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为2-4μm的薄层切片；

所述的检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况，步骤如下：

1)烤片：CTC蜡块薄层切片在60℃恒温箱中烤片2小时；

2)脱蜡：切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟；

3)水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟，自来水、蒸馏水冲洗；

4)抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，800W加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；

5)蒸馏水冲洗；

6)去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；

7)蒸馏水冲洗；

8)PBS浸洗5次各1.5分钟；

9)滴加一抗，4℃冰箱中过夜，然后将其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分钟；

10)滴加二抗；

11)37℃水浴锅中孵育20分钟；

12)PBS浸洗5次各1.5分钟；

13)显微镜下控制，DAB显色；

14)自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；

15)自来水冲洗5分钟；

16)75％-95％-100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；

17)细胞病理学专家阅片，判读PR表达情况。