[发明专利]晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测PR基因的新方法，尤其是通过外周血检测晚期乳腺癌患者PR基因的方法。

背景技术

目前作为预后因子的孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)是ER的产物，可以引起和增强雌激素对ER的反应，起到促进和协同的作用，其已成为制定乳腺癌患者内分泌治疗方案时最重要的指标，只有ER阳性时，内分泌治疗有效率为50％-60％，如果ER、PR均为阳性时，有效率可高达70％-80％，而同时阴性者有效率为10％。现有的乳腺癌PR的检测需要通过手术或穿刺活检等方式获得原发瘤或转移瘤的肿瘤组织标本，然而不是每一位患者都能获得肿瘤组织样本，而且不能在治疗过程中进行连续的检测，限制了其成为有效的疗效监测指标。但脱落入血的CTC可以给我们提供潜在的实时肿瘤标本，其突变状态同样可以用于指导治疗。

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。

目前CTCs检测的主要方法包括依赖肿瘤相关标志物检测的免疫学检测技术及基于形态学富集的膜过滤技术(Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。前者是基于细胞表面表达不同抗原标志，将针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加磁场筛选富集CTCs。该技术的优势在于特异度较高，已有商品化的半自动检测设备(CellSearch)；但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异，利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉，分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准，该富集技术特异性相对较差。

发明内容

为了克服传统循环肿瘤细胞检测技术及晚期乳腺癌患者不适宜组织标本取材--进而无法评估患者PR状态的不足，本发明提供了一种晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PR基因的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC；利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而通过免疫组织化学技术检测晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的PR表达情况。

该方法具体步骤如下：

一、利用膜过滤装置分离获取晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：

1、采集晚期乳腺癌症患者外周血：肘正中静脉10ml，均分为2管编写相同编号后，分别命名为实验1组和实验2组；

2、将2管外周血样分别进行预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；

3、利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

4、过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器，PBS冲洗2-3次，外周血循环肿瘤细胞被截留在滤膜上。

二、利用细胞免疫荧光技术鉴定晚期乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞：

1、向实验1组分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器中加入Cytoperm/Cytofix试剂300μl，固定、穿孔15min；

2、PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入wash buffer 300μl，封闭30min；

3、加入CK8/18/19、CD45一抗混悬液300μl，两种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；

4、Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl，两种二抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育30min；

5、Wash buffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst 300μl，洗染细胞核5min；

6、PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜置于载玻片上，滴加10μl抗荧光淬灭封闭液封片；

7、荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录CTC情况，确定是否存在CTC；如观察到CTC则继续进行下一步检测，否则停止检测。

三、运用细胞蜡块技术制作CTC细胞蜡块：