[发明专利]一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法

权利要求书

1.一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于，所述方法为利用膜 过滤装置分离获取外周血循环肿瘤细胞，然后利用细胞免疫荧光技术鉴定 外周血循环肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于， 所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台 (1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述 血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2) 的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液 缸(5)设置于底座(11)上。

3.根据权利要求2所述的外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于： 所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下 口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上口(6)接血样容器(2)， 滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。

4.根据权利要求3所述的外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于： 所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。

5.根据权利要求1所述的外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于， 所述的利用膜过滤装置分离获取外周血循环肿瘤细胞，步骤如下：

A、采集晚期癌症患者外周血：肘正中静脉5ml；

B、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA),稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；

C、利用膜过滤装置分离预处理后的外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞： 将预处理后的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器(2)中，使其依 靠重力自然过滤；

D、过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器(3)，PBS冲洗2-3次，外周 血循环肿瘤细胞被截留在滤膜(7)上。

6.根据权利要求1所述的外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法，其特征在于， 所述的利用细胞免疫荧光技术鉴定外周血循环肿瘤细胞，步骤如下：

A、向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器(3)中加入Cytoperm/Cytofix 试剂300μl，固定、穿孔15min；

B、PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入washbuffer300μl，封闭30min；

C、加入CK8/18/19、CD45、AFP一抗混悬液300μl，三种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；

D、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl， 三种二抗均以washbuffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下 避光孵育30min；

E、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst300μl，洗 染细胞核5min；

F、PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜(7)置于载玻片上，滴加 10μl抗荧光淬灭封闭液封片；

G、荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录，确定是否存在CTC。