[发明专利]一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离获取并鉴定晚期癌症患者外周血中循环肿瘤细胞的 方法。

背景技术

外周血循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTC)存在于多种恶 性肿瘤中，其检测对于肿瘤早期诊断、预后分析、疗效检测以及个体化治疗 等众多方面具有重要的临床意义，并因能够实时检测、创伤小等优点成为备 受关注的“液态活检”。

目前CTC检测的主要方法是依赖肿瘤相关标志物检测的免疫学检测技术。 该技术是基于细胞表面表达不同抗原标志，将针对肿瘤细胞表面抗原的特异 性抗体EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加 磁场筛选富集CTC。该技术的优势在于特异度较高，已有商品化的半自动检测 设备(CellSearch)，但肿瘤特异性抗原表达的缺失会造成假阴性结果。

发明内容

为了克服目前循环肿瘤细胞检测技术存在的不足，本发明提供了一种外 周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法。该方法利用膜过滤装置分离获取外周血循 环肿瘤细胞，然后利用细胞免疫荧光技术鉴定外周血循环肿瘤细胞。

该方法具体步骤如下：

1、利用膜过滤装置分离获取外周血循环肿瘤细胞：

A、采集晚期癌症患者外周血：肘正中静脉5ml；

B、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后用4％多聚甲醛固定外周血样10分钟；

C、利用膜过滤装置分离外周血样，富集外周血循环肿瘤细胞：将预处理 的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

D、过滤结束后，从膜过滤装置中取下滤器，PBS冲洗2-3次，外周血循 环肿瘤细胞被截留在滤膜上。

2、利用细胞免疫荧光技术鉴定外周血循环肿瘤细胞：

A、向分离获取外周血循环肿瘤细胞的滤器中加入Cytoperm/Cytofix试剂 300μl，固定、穿孔15min；

B、PBS漂洗3次，每次5分钟，之后加入washbuffer300μl，封闭30min；

C、加入CK8/18/19、CD45、AFP一抗混悬液300μl，三种一抗均以wash buffer稀释，混匀后的终浓度为1:250，室温下孵育45min；

D、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入二抗混悬液300μl， 三种二抗均以washbuffer稀释，混匀后的终浓度为1:500，室温下避光孵育 30min；

E、Washbuffer洗涤3次，每次5分钟，之后加入Hoechst300μl，洗 染细胞核5min；

F、PBS漂洗2次，每次3分钟，之后取出滤膜置于载玻片上，滴加10μ l抗荧光淬灭封闭液封片；

G、荧光显微镜下2h内观察结果，拍照、记录，确定是否存在CTC。

外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法中所述的膜过滤装置，包括滤器、血 样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容 器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联 通至废液缸，废液缸设置于底座上。

所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤 膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。

所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。

有益效果：借助于ISET技术分离富集CTC，依靠细胞免疫荧光技术鉴定 CTC，不仅能够克服单纯ISET技术鉴定CTC存在的困难，亦能捕获上皮抗原 表达减弱或缺失的肿瘤细胞，即克服单纯免疫学检测技术存在的假阴性。同 时，该技术设备要求不高，方法易于掌握，并能实时监测。

附图说明

图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；

图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；

图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；

图4为本发明一例晚期肝癌患者检测到的循环肿瘤细胞影像图。

图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、 7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。

具体实施方式