[发明专利]一种龙眼快速转基因方法

权利要求书

1.一种龙眼快速转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)龙眼直播实生幼苗的准备；

(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备；

(3)实生幼苗去顶芽或去顶、切除带叶的上部材料的制备、侵染和共培养；

(4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；

(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；

(6)转基因植株的移植；

步骤(1)所述的龙眼直播实生幼苗准备方法为：取8成熟以上的龙眼，剥去果皮与果肉，选健康饱满的种子，用清水洗种子后直播于穴盘的营养土中，每穴播1粒种子，25℃温室中暗培养1周，待种子萌发出土后，转移至25℃温室中光照培养2周，至4片真叶期；

步骤(3) 实生幼苗去顶芽材料制备、侵染方法为：将4片真叶期幼苗的顶芽去掉保留真叶，用棉花吸取OD₆₀₀为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液后，用摄子将带菌液的棉花紧贴在去顶芽的位置侵染20 min后，用新的带侵染菌液棉花再次侵染20 min，弃带侵染菌液棉花，将吸有无菌水的棉花贴在去顶芽处保湿；

步骤(3) 实生幼苗去顶材料制备、侵染方法为：将4片真叶期实生幼苗去顶，所述去顶为切除带叶的上部，茎部保留1.5cm-3.5cm，用可拉伸的封口膜或保鲜膜在茎部的切口处缠绕成一小塑料杯形，将OD₆₀₀为0.4-1.0的根癌农杆菌菌液用移液器转移60 ul至小塑料杯形内，在切口处侵染20 min，用棉花吸干后再重复侵染20 min，用棉花吸干，将封口膜或保鲜膜封住切口保湿；步骤(3)所述的共培养为：在28℃下暗培养4天。

2.根据权利要求1所述的一种龙眼快速转基因方法，其特征在于，步骤(2)所述的转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备方法为：将携带pCAMBIA1301、pCAMBIA1301-MFT、pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体的根癌农杆菌菌液，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素的25ml YEB液体培养基上，28℃、200 rpm/min暗培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，4000 rpm/min离心10 min收集菌体，并重悬于无抗生素、含有100μM 的乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25ml MS液体培养基中，28℃振荡培养2小时后调OD₆₀₀至0.4-1.0，用于侵染；pCAMBIA1301-MFT载体制备方法：在MFT基因开放阅读框两端设计特异引物MFT-F：ATTCTCTAGAATGGCGGCTTCGGTGGATC，MFT-R：GGGGTACCTTAGCGGCGACGGTTGGCC，扩增MFT基因并进行TA克隆、测序，XbaI和KpnI双酶切TA克隆质粒与pSPROK质粒载体后将MFT基因连接到pSPROK载体上，获得pSPROK-MFT，将pSPROK-MFT和pCAMBIA1301用HindIII与EcoRI双酶切后，将pSPROK-MFT双酶切产物35S-MFT-NOS连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT表达载体；pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体制备方法：根据MFT基因序列，设计二对方向相反的引物，扩增RNAi正反向插入片段，正向片段引物MFT(+)-F:ATTCTCTAGAAGTGGTGGGTCGGGTTATT，MFT(+)-R: ATTCTCTAGACGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为XbaI酶切位点；反向片段引物MFT(-)-F: TATAGCGGCCGCAGTGGTGGGTCGGGTTATT，下划线为NotI酶切位点，MFT(-)-R: TATAGCGGCCGCCGGTTCCTTCTGAGCATTG，下划线为BamHI酶切位点；正反向片段TA克隆、测序验证后用相应的限制性内切酶切下，连接到pJM007干扰载体上，构建pJM007-MFT-RNAi载体；用PstI酶切pJM007-MFT-RNAi，回收小片段后，用CIAP进行去磷酸化，用PstI酶切pCAMBIA1301后，将去磷酸化片段连接到pCAMBIA1301上，构建pCAMBIA1301-MFT- RNAi表达载体。