[发明专利]一种龙眼快速转基因方法

说明书

本发明提供了龙眼快速转基因方法，属于转基因植物制备领域。它包括龙眼实生幼苗的准备，转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备，实生幼苗去顶芽或去顶（切除带叶的上部）材料的制备、侵染和共培养，抗性芽的筛选与培养，再生抗性芽的分子生物学鉴定，转基因植株的移植。完全不依赖植物组织培养，以直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料进行侵染，获得转基因植株；不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞，转基因抗性芽不需继代转接，成活率高，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。

技术领域

本发明涉及龙眼的快速转基因方法，属于转基因植物制备领域，主要应用于龙眼的种质资源创新。

背景技术

龙眼种质创新所应用的转基因方法的研究较少，实验室主要用根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，所用的外植体有胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系，以根癌农杆菌介导的转化法、基因枪转化法，利用胚状体、愈伤组织的悬浮细胞系为外植体需无菌培养，周期长，成本也高，目前也只得到转化的胚状体，这两种方法并未得到龙眼转基因植株。曾黎辉等采用发根农杆菌介导法，侵染龙眼的胚状体和无菌试管苗，对产生的96条发状根进行培养，只有3条毛状根经体胚发生途径产生胚状体，然后再分化成小植株，得到3个转基因株系，阳性率3.125%，与正常龙眼植株相比，转化植株表现出叶片薄和变小、生长缓慢、卷成茎的形状等异常现象。研究表明发根农杆菌介导法的缺点为转基因植株会表现出顶端优势丧失、叶片皱缩、节间缩短和花形改变等异常现象；此方法还过度依赖植物组织培养，获得胚状体或转化植株的周期长，成本高，转化效率低，后期还需要进行炼苗与移栽等过程，转基因植株容易由此过程造成死亡。

发明内容

本发明的目的在于提供龙眼快速转基因方法，完全不依赖植物组织培养，以直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料进行侵染，获得转基因植株；不需培育无菌试管苗、胚状体和悬浮细胞，转基因抗性芽不需继代转接，成活率高，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种龙眼快速转基因方法，包括以下步骤：

(1)龙眼直播实生幼苗的准备；

(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备；

(3)实生幼苗去顶芽和去顶（切除带叶的上部）材料的制备、侵染和共培养；

(4)去顶芽和去顶幼苗的抗性芽筛选与培养；

(5)再生抗性芽的分子生物学鉴定；

(6)转基因植株的移植。

不依赖植物组织培养，以穴盘直播的实生幼苗的去顶芽和去顶材料快速获得转基因植株的方法。

具体方法为：

步骤(1)龙眼直播实生幼苗准备方法为：取8成熟以上的龙眼，剥去果皮与果肉，选健康饱满的种子，用清水洗种子后直播于穴盘的营养土中，每穴播1粒种子，25℃温室中暗培养1周，待种子萌发出土后，转移至25℃温室中光照培养2周，至4片真叶期。

步骤(2)转化载体根癌农杆菌侵染菌液的准备方法为：将携带pCAMBIA1301、pCAMBIA1301-MFT、pCAMBIA1301-MFT-RNAi载体的根癌农杆菌菌液，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素的25ml YEB液体培养基上，28℃、200 rpm/min暗培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，4000 rpm/min离心10 min收集菌体，并重悬于无抗生素、含有100μM 的乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 ml MS液体培养基中，28℃振荡培养2小时后调OD₆₀₀至0.4-1.0，用于侵染。