[发明专利]农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法

权利要求书

1.农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；

(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；

(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；

(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；

(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；

(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株；

所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L；其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L；

所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na₂·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B6 0.1mg/L+维生素B1 0.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L；

所述共培养培养基的组成如下：FM+半胱氨酸200mg/L+琼脂4g/L；

所述恢复培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+琼脂4g/L；

所述筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1-2mg/L+萘乙酸0.01-0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L；

所述生根培养基的组成如下：MSB+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L；

步骤(2)将胚尖浸入农杆菌菌液中，用50-150瓦超声波处理1-10分钟，然后转入23℃，100rpm摇床中侵染2小时；

步骤(3)将侵染后的胚尖移至FM培养基上共培养，于23℃，16小时光照/8小时黑暗共培养2-4天；

步骤(4)中培养条件为：36℃，16小时光照/8小时黑暗，培养3天，然后于25℃光照培养室内培养4天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中棉花种子去绒灭菌的具体方法为：将棉花种子用95％浓硫酸浸泡脱去表面短绒，然后用清水冲洗，晾干；将种子用75％乙醇浸泡10-15分钟，弃掉乙醇，然后浸泡于20％过氧化氢中，在100rpm摇床上室温震荡1-2小时，最后用无菌水冲洗3-5次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用农杆菌EHA105，所述农杆菌菌液的OD₆₆₀值0.1-1.0。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的农杆菌菌液的OD₆₆₀值0.9。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述棉花品种包括Coker312、鄂棉24。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述质粒为pZZ00090，其全序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)将胚尖浸入农杆菌菌液中，用100瓦超声波处理2分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L。