[发明专利]农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法

说明书

本发明提供一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，首次采用吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。

背景技术

棉花是重要的经济作物，自1987年Umbec等首次报道将外源基因成功导入陆地棉以来，目前棉花转基因技术主要采用基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法因转化效率低，设备成本较高，且转基因拷贝数偏高，不利于进行商业化育种。王振怡等通过基因枪介导棉花转化，得到1.6％的转化效率。农杆菌介导法进行转基因棉花实验，受体材料的种类较多，可以利用棉花下胚轴、子叶、萌发数天的茎尖为侵染材料。下胚轴及子叶可通过愈伤组织诱导途径诱导胚状体的形成，是目前较常用的方法。但该方法转化周期长，体细胞无性系变异严重，转化效率低，且对品种的依赖性很高。易于转化的品种例如，YZ1等转化周期长达6个月。李燕娥等用农杆菌转化棉花品系9422的下胚轴，耗时4-5个月才获得转基因植株。常规的农杆菌侵染茎尖的方法，需将棉花先进行萌发，取幼苗的茎尖作为外植体材料，其缺点包括形成抗性芽少，易形成嵌合体，转化效率低等。

因此，开发适合商业化生产的棉花品种的高效稳定的转基因方法，对于加快棉花的遗传育种进程意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于工业化规模的向棉花中导入外源基因的高效转基因方法，即农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，包括以下步骤：

(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；

(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；

(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；

(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；

(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；

(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株。

所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L。其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L。MS基本培养基见表1。

表1 MS基本培养基的配方

所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na₂·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES(2-吗啉乙磺酸)3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B6 0.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L。

所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸。