[发明专利]一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用。本发明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到糯性玉米，所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量；玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。采用本发明提供的方法能够实现对玉米的基因编辑，获得糯性玉米，具有很高的育种和栽培价值。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物和饲料作物，玉米淀粉在人类生活及工业生产中应用广泛，所含的直链淀粉和支链淀粉具有很高的经济价值。由于支链淀粉的理化特性使支链淀粉在食品加工、畜牧养殖、造纸业、纺织业以及粘着剂工业等领域具有较大的应用空间，因此培育糯性玉米对生产及加工具有重要意义。

糯性玉米又称蜡质玉米，是指玉米籽粒成熟后胚乳中支链淀粉含量几乎为100％，且胚乳呈角质不透明且无光泽的蜡质状，蒸煮后呈黏性故又称粘玉米。糯性是一个普遍的突变性状，天然糯性突变体在玉米、水稻、大麦、高粱等二倍体中禾谷类作物中非常常见。糯性玉米独特的性状是由受waxy1单基因隐形突变控制的，Sprague等(1943)识别了位于玉米9号染色体短臂的waxy1基因位点，野生型Waxy1基因全长3718bp，由14个外显子和13个内含子构成，编码颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSSI)，该酶主要控制玉米胚乳和花粉的直链淀粉合成。如果waxy1基因缺失、表达受阻或GBSSI酶活性降低，将导致胚乳直链淀粉合成受阻，胚乳中直链淀粉含量降低，从而改变淀粉的糊化和膨胀等特性形成具有糯性性状的糯性玉米。目前已经发现超过50个waxy1等位基因，突变位置遍布整个waxy1基因，其中相当一部分是不同的转座子插入相同位置或者相同的转座子插入不同的位置造成的不稳定糯性突变如wx-7、wx-8、wx-9等(klosgen 1986)，还有一些稳定的waxy1突变体是在waxy1基因关键位置发生缺失或插入突变，如wx-D7、wx-D10分别是waxy1第7外显子和第10外显子发生碱基缺失导致突变的发生(fan，2008；田孟良2008)。

CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术首先设计的一段sgRNA基因，该基因转录的RNA可以通过碱基互补配对识别目标DNA序列，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。基于细菌Ⅱ型免疫机制开发的基因编辑技术在植物特别是作物遗传改良上具有重大的应用前景。该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,single guiding RNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点，然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何培育糯性玉米。

为解决上述问题，本发明首先提供了培育糯性玉米(支链淀粉含量高的玉米)的方法。

本发明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到糯性玉米。

所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量。

所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因。

所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白可为a1)或a2)：