[发明专利]一种非诊断目的的粪便微生物耐药性基因的检测方法

说明书

本发明公开了一种非诊断目的的粪便微生物耐药性基因的检测方法。所述方法包括：确定耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；向待测样品中加入外源核酸，得到混合样品并提取基因组；向基因组中加入外源标准基因，获得混合核酸；扩增混合核酸，利用扩增产物构建高通量测序文库并进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，并根据获得的外源标准基因和内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若实验成功，则计算耐药性基因的含量；根据耐药性基因的含量判定待测样品是否含有耐药性基因。所述方法可以一次性定量检测任意微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，且检测不需要培养与纯化微生物，速度快，结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种非诊断目的的粪便微生物耐药性基因的检测方法。

背景技术

抗生素类药物广泛应用于防治人体疾病，滥用抗生素类药物会导致微生物进化出耐药性基因，并产生耐药性，这使得抗生素类药物在防治疾病时失效。粪便中微生物耐药性基因是肠道类疾病用药的重要依据。

现有的检测耐药性基因的方法包括：预估待测样品上携带的需要检测的耐药性基因的病原菌，分离并纯化该病原菌，通过PCR(Polymease Chain Reaction，聚合酶链式反应)引物扩增该耐药性基因，利用电泳或实时定量PCR方法逐一判断待测样品中是否存在需要检测的耐药性基因。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题中的一种：

需要培养、分离和纯化病原菌，使得检测的时间较长，延误治疗时机；无法检测不可培养的耐药菌中的耐药性基因；一次只能针对一种或少数几种病原菌进行检测；一次只能检测一种或少数几种耐药性基因，不能检测到待测样品中所有的耐药性基因，不能给予用药所需的全面信息；不能实现耐药性基因的定量检测。

发明内容

为了解决现有技术中检测耐药性基因的方法有待提高的问题，本发明实施例提供了一种非诊断目的的粪便微生物耐药性基因的检测方法。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种非诊断目的的粪便微生物耐药性基因的检测方法，所述方法包括：

确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为粪便；

制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合样品；

提取所述混合样品的基因组；

向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；

利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；

对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；

分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；

根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；

若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；

根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。

具体地，所述耐药性基因至少为1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准基因至少为1个。

具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的微生物中的基因。