[发明专利]一种在血浆和血清中检测miRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种在血浆和血清中检测miRNA的方法。

背景技术

2008年Mitchell PS等发现血浆中miRNA能以稳定的形式存在，避免内源性RNA酶的降解。同年Shlomit G等证实miRNA可以在血浆和其他体液中稳定存在，并且表达谱随不同病理生理状态而改变。由于外周静脉血获取简单且病人容易接受，克服了样本量不足等困难，使得循环miRNA在疾病诊断中的应用研究成为研究的热点。

最常用且有效的miRNA表达检测技术是荧光定量PCR法。目前通用步骤为：抽提样本RNA，逆转为miRNA cDNA，荧光定量检测miRNA表达水平。第一步抽提样本RNA较困难。由于血浆miRNA含量较低，若样本量较少时提取的RNA量不足后续试验。最常用的血浆循环RNA抽提法沿用传统TriZol抽提法：TriZol裂解，氯仿萃取，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解。此方法提取效率低，对样本量要求大，而且有机试剂的残留会抑制后续PCR反应，造成miRNA检测效率下降。市场上的试剂盒抽提法为：裂解，萃取，磁珠或吸附柱吸附，洗涤，溶解。该方法通常会使用磁珠或吸附柱，会造成RNA的损失、破坏RNA的完整性，对样本需求量大而且费用较高。

并且，传统的血浆miRNA检测方法复杂，耗时间，成本高，重复性低，不利于临床推广和应用。

因此，本领域迫切需要开发一种简化检测方法、降低成本、提高重复性的在血浆和血清中检测miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供了一种简化检测方法、降低成本、提高重复性的在血浆和血清中检测miRNA的方法。

本发明第一方面提供了一种非诊断性的免抽提的对测试样品进行miRNA检测的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供一测试样品，所述测试样品为血浆和血清样品，将所述测试样品和预处理缓冲液混合，形成第一混合物，其中所述预处理缓冲液包括非离子型表面活性剂；

(ii)将所述第一混合物进行加热处理，得到经处理的第二混合物；和

(iii)将所述第二混合物直接用作模板，检测所述测试样品中的miRNA的种类和/或含量。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述预处理缓冲液包括一种或多种选自下组的非离子型表面活性剂：吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)、Triton X-100、NP-40、或其组合。

在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂包括吐温20(TWEEN-20)。

在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂的浓度(V/V)为0.5-10％，较佳地，1-5％，更佳地，2-4％。

在另一优选例中，所用溶剂为水。

在另一优选例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5-10wt％，较佳地，1-5wt％，更佳地，2-4wt％。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述预处理缓冲液的pH为6-9，较佳地，7-9，更佳地，7-8。

在另一优选例中，所述预处理缓冲液还包括Tris-HCl缓冲液。

在另一优选例中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为25-150mM，较佳地，30-100mM，更佳地，30-80mM。

在另一优选例中，所述预处理缓冲液还包括金属螯合剂。

在另一优选例中，所述金属螯合剂选自下组：EDTA、EGTA、或其组合。

在另一优选例中，所述金属螯合剂包括EDTA。

在另一优选例中，所述金属螯合剂的浓度为0.5-2.0mM，较佳地，0.5-1.5mM，更佳地，0.8-1.2mM。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述加热温度为60-80℃，较佳地，70-75 ℃。

在另一优选例中，在步骤(iii)中，用荧光定量PCR的方法检测测试样品中的miRNA的含量。

在另一优选例中，所述miRNA来自于哺乳动物，优选人。

在另一优选例中，所述方法不包括抽提RNA的步骤。

在另一优选例中，所述方法为非治疗非诊断性的。

在另一优选例中，所述方法检测所述测试样品中选自下组(A)的一个或多个miRNA的种类和/或数量：miR-20b、miR-106a、miR-16。