[发明专利]一种进行固相PCR反应的自动化微流工作站及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种基于微流控芯片的固相PCR&单碱基延伸反应， 对接核酸质谱检测，主要应用于单核苷酸多态性检测，尤其是一种适用于一站式自动化、多 样本、高通量、快反应、低成本的SNP检测样本前处理，可与核酸质谱检测仪如MALDI-TOF-MS 直接对接，进行SNP位点检测。

背景技术

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)是指个体基因组内特定核苷酸 位置上的单个碱基A，T，C，G的改变而引起的DNA序列的改变或突变，这种突变包括单 碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来说，只有当等位基因的频率大于或等于1％时才 能称得上是SNPs，然而部分SNPs数据库如HGVBase把等位基因的频率小于1％的变异也包 括在SNPs内。研究表明，人类每对等位染色体上每1000bp就会出现1个SNP，而整个人类 基因组每300bp就会出现1个SNP，在任意两个个体之间，就有好几百万的单碱基差异和十 万个氨基酸的不同，在一定程度上反映了人类个体或群体的特异性，也造成人类在内的物种 之间染色体基因组的多样性。

对人类基因组的SNP进行大规模的研究具有重要的意义，它不仅可以研究人类的起源、 进化和群体遗传学特征，而且为多基因病和复杂性疾病如人类肿瘤、糖尿病、心血管疾病、 自身免疫性疾病、精神病、老年性痴呆等相关基因的研究和药物遗传学的研究提供了科学基 础和先进手段。SNP检测是目前基因诊断的主要研究内容。同时，SNP检测所代表的基因诊 断也逐渐成为新生儿或特定人群遗传病筛查的重要手段之一。

由于SNP其重要性，并且随着SNP研究的普及和深入，SNP的检测方法目前已有了长 远的发展，如全基因组测序，外显子组测序，全基因组SNP芯片，质谱法，SNPseq法，SNPlex， SNaPshot等，都可以快速、高效、较大通量检测基因组中的SNP，但这些设备价格昂贵，仅 适用于大型实验室的研究，难以在普通实验室进行普及。

质谱法是SNP位点检测的常用方法和最具前景的技术。质谱法是通过对物质的分子量 (质荷比)进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。SNP位点两个等位基因之间存在分子量 差异，通过分型实验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可达到SNP分型的目的。其主 要是在紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP， dideoxy-nucleosidetriphosphate)替代dNTP脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP，deoxy-nucleotide thiophosphate))，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探 针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪可以检测出这种微小的分子量差异， 从而实现SNP分型的目的。

其中，MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统由专业生产生物芯片系统用于遗传突变及 SNP领域研究的美国Sequenom公司开发，是目前采用质谱法直接检测SNP的成熟设备。该 系统的突出特点是能以极高的精确度进行基因型识别，直接测出带有SNP或其他突变的目 标DNA。由于质谱法直接检测分子的本质特征-分子量，不需要通过荧光标记来进行间接检 测，准确可靠；灵敏度高，可检测低至10ng的核酸片段。然而，国外公司利用质谱仪对SNPs 位点进行检测的方法，在样本前处理过程中存在不少缺陷。如Sequenom的标准流程采用的 是两步PCR：普通PCR预扩增和单碱基延伸PCR扩增，即放大含待检测SNP位点的ssDNA 模板和放大含SNP位点的延伸产物；PCR预扩增需要45个循环，单碱基延伸循环需要40 个外循环且每个外循环又内嵌5个内循环反应；且在两次PCR扩增之间，还需要使用虾碱 性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP)消化除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP 和引物；这样就造成样本处理时间的延长、试剂消耗及检测成本的增加，尤其整个流程操作 需要长达10个小时左右，不利于样本的即时检测。