[发明专利]抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗 乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：

S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；

S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；

S3：筛选获得CouKRS-pBK质粒，该质粒包括能够特异识别7-羟基香豆 素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；

S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的 DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；

S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的 anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到 大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；

S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对 菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧 光抗体。

2.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述步骤S1包括如下步骤：

S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；

S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上， 获得重组质粒PylRS-pBK；

S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引 物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、 引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；

S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引 物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物 r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例 混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库 lib-PylRS-pBK。

3.如权利要求2所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述第二预设比例为1:1:32:1。

4.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二 预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；

S202：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于 60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆 素母液C。

5.如权利要求4所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。

6.如权利要求5所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。

7.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述第一预设比例为1:1。

8.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特 征在于，所述特定的物质为7-羟基香豆素母液C、卡那霉素、四环素和L-阿 拉伯糖组成的混合物。