[发明专利]抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体 的制备方法。

背景技术

乙肝病毒(HBV)慢性感染是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的主要原因， 每年有近100万人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。目前中国 有近1亿HBV慢性感染人群，每年仍有10万例新发HBV感染者。

乙肝e抗原的定量是医生判断病情和指导治疗的重要依据。受技术所限， 乙肝e抗原的检测一直处于手工定性或者半定量状态。最近，国外的公司有 通过化学显色的方法来定量乙肝e抗原，然而化学显色方法灵敏度低，检测 不到血液中低丰度的乙肝e抗原，会给乙肝e抗原的检测带来误判。荧光发光 检测的方法灵敏度高，可以检测到样本中单个拷贝的靶标。

基于此，有必要设计一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，用来 大幅度提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加 强对乙型肝炎的发病的监控力度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法， 旨在提高乙肝e抗原的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于乙肝e抗原 的精确定量检测。

为实现上述目的，本发明提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备 方法，所述抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：

S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；

S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；

S3：筛选CouKRS-pBK质粒，该质粒中包含特异识别7-羟基香豆素的吡 咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；

S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的 DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；

S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的 anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到 大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；

S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对 菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧 光抗体。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；

S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上， 获得重组质粒PylRS-pBK；

S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引 物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、 引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；

S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引 物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物 r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK 为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例 混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库 lib-PylRS-pBK。

优选地，所述第二预设比例为1:1:32:1。

优选地，所述步骤S2包括如下步骤：

S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二 预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；