[发明专利]硫黄素T适配体、其筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种硫黄素T适配体、其筛选方法及用途。本发明利用SELEX方法筛选出光开关染料硫黄素T的适配体序列，并利用硫黄素T的光开关特性以及所述适配体与硫黄素T结合前后的结构变化设计了KRAS基因突变检测的非标记荧光生物传感器，并藉此实现了简单、高效、高选择性的KRAS基因突变检测，能够为肿瘤早期诊断和用药指导提供有效的帮助。

技术领域

本发明涉及一种光开关染料适配体，特别是一种改良的硫黄素T适配体，其筛选技术以及应用，例如在KRAS基因突变的非标记检测中的用途，属于生物技术领域。

背景技术

适配体是利用指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands byexponential enrichment,SELEX)技术从体外庞大的核酸分子文库中筛选获得的单链DNA或RNA。适配体具有高特异性、高亲和度、易合成、易修饰、分子小、无毒以及良好的稳定性等优点，因此在生物传感器中运用十分灵活，是生物传感器理想的识别元件。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简单、快速、适用范围广等优点。

KRAS基因12号和13号外显子突变是大肠癌的普遍特征。KRAS基因检测是目前医生了解大肠癌等癌症患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的癌症患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法。因此发展高效检测KRAS基因突变的方法非常必要。目前，实时定量PCR，DNA杂交或者测序等方法均被用于癌基因突变的检测，但是这些检测方法都只能小规模应用，而且价格昂贵，需要一些大型仪器的辅助。与这些方法相比，生物传感器显示出了很大的优势。

具有光开关性质的染料小分子与某些核酸链作用，会发生荧光信号的变化。基于这种性质，以核酸链为基础，将核酸链和光开关染料作为探针，设计非标记的生物传感器，可以实现不同的检测目的。这种方法不仅简单，方便，不用标记，而且不需要依赖于大型仪器和设备，因此展现出了良好的应用前景。目前利用这种方法进行检测已有一些相关报道，但用到的核酸链多为G四链体，由于G四链体可以与多种物质作用并且其效果对环境的要求非常严格，容易受到多种因素的影响。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种硫黄素T适配体、其筛选方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种光开关染料适配体的筛选方法，其包括：将单链DNA文库与捕获链杂交形成杂交文库，之后分离出与所述光开关染料作用的DNA序列，再PCR扩增富集、迭代筛选，从而获得所述光开关染料适配体。

本发明实施例提供了一种硫黄素T适配体的筛选方法，包括以下步骤：

1)将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；

2)将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱，之后以硫黄素T溶液将与硫黄素T特异性作用的富集库洗脱；

3)收集所述富集库并进行PCR扩增，获得筛选文库；

4)以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1)～步骤3)的操作，直至获得所述硫黄素T适配体。

较为优选的，所述单链DNA文库具有SEQ ID No.1所示的序列，该序列中的n为随机碱基。

较为优选的，所述捕获链具有SEQ ID No.2所示的序列。

本发明实施例提供了一种硫黄素T适配体，其具有SEQ ID No.3所示的序列。